生物醫用材料的基本要求精品(七篇)

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篇(1)

【關鍵詞】：細胞毒性;骨水泥;組織相容性;MTT法

骨粘固劑，常用名為骨水泥，其主要成分是聚甲基丙烯酸甲酯。1951年，瑞典Klaer用PMMA作為髖關節假體固定材料;1988年Charnley深入研究并推廣使用，從而使骨粘固劑固定假體置換獲得成功;我國從1978年研制成功并應用與臨床，主要用于人工關節置換手術。應用MTT法檢測細胞的活性是近年來評價生物相容性的一種簡便、高效的方法。本試驗旨在通過對兩種國產骨水泥的細胞毒性試驗的研究，闡述其應用的安全性。

1.試驗材料 1.1 實驗材料和對照品

試驗選取某國產骨水泥及同廠家帶慶大霉素的骨水泥。骨水泥的組成為：粉劑20g（聚甲基丙烯酸甲酯 17.60g，硫酸鋇2.00g，過氧化苯甲酰0.40g）;液體 10ml（甲基丙烯酸甲酯 9.87ml，對苯二酚 75ppm，N，N二甲基對甲苯胺

供試品的制備：室溫下，在無菌條件下將粉劑倒入骨水泥攪拌器中，然后將液體倒入粉劑中，充分攪拌約1.5min，混合均勻后等待3-5分鐘后放入樣品容器。稱取兩種骨水泥的重量，按照0.2g/ml的浸提比例，加含10%血清的MEM培養基為浸提介質，制成浸提原液。陰性對照組：按照6cm2/ml的比例，取24cm2高密度聚乙烯，加4.00mL浸提介質。陽性對照組含5% DMSO的浸提介質。 1.2 菌株和細胞

小鼠成纖維細胞，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（NCTC clone-929）。

1.3培養基及試劑

胎牛血清（Gibco公司）10%;MEM培養基干粉（Gibco公司）配置成原液;四唑鹽（MTT）生工生物工程（上海）有限公司5g/L ;二甲基亞砜（DMSO）Merck公司5% ;胰酶溶液（Gibco公司）0.25% ;雙抗（10000U/mL）Gibco公司1%。

2.試驗方法

細胞毒性試驗―MTT法[2，3]

2.1 在無菌的條件下，取供試樣品制備浸提液。分別取供試品骨水泥及慶大霉素骨水泥4g，按照0.2g/ml的浸提比例，加浸提介質20mL，制成浸提原液。

陰性對照組：按照6cm2/ml的比例，取24cm2高密度聚乙烯，加4.00mL浸提介質。

陽性對照組： 含5% DMSO的浸提介質。浸提溫度為37℃，浸提時間為24 h。

2.2 接種細胞：將傳代48～72h生長旺盛的細胞，經2.5g/L胰酶溶液消化制成濃度為 1×104 個/mL的細胞懸液接種于96孔板，設空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品浸提原液組，每組均為12孔，每孔接種100?L細胞懸液，置37℃、5%CO2培養箱內培養24h。

換液培養：24h后，棄去原培養液，空白組加入細胞培養液，陰性對照組加入高密度聚乙烯浸提液，陽性對照組加入含5%DMSO的培養液，供試品組加入浸提原液，每孔100?L，置37℃、5%CO2氣體培養箱內繼續培養 72 h。結果測定：經接觸培養后，置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入20?L質量濃度為5g/L MTT溶液，繼續培養4h后棄去孔內液體，加入150?L DMSO，置振蕩器上振蕩10min，在酶標儀570nm和630nm波長下測定吸光度。

3.數據統計及試驗結果：

3.1空白對照組、陰性對照組、供試品浸提原液組及陽性對照組的吸光度采用雙波長法測定（570nm-630nm）。

3.2計算公式：相對增殖率（RGR）=試驗樣品組吸光度/空白對照組吸光度×100% 3.3結果評定： 按照GB-T/14233.2-2005醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第二部分：生物學試驗方法的細胞相對增殖率分級標準作為判定依據。

陰性對照的反應不大于1級，陽性對照組至少為3級反應。如陰性對照和陽性對照組反應不成立時應重新試驗。

4.試驗結果

MTT比色法結果如下：

根據本實驗結果進行結果分級：慶大霉素骨水泥的細胞相對增殖度為2級（74.1%），骨水泥的細胞相對增殖度為2級（61.4%）。結果判定為：反應觀察至多50%的細胞呈圓形，無胞漿內顆粒;明顯可見細胞溶解和細胞間空區。

按照GB/T 14233.2-2005檢驗醫療器械時，一般認為可接受的細胞毒性反應為不大于2級。

5.討論

骨水泥需要長期與人體骨組織接觸， 其組織相容性的優劣直接影響臨床療效，對骨水泥的生物安全性研究主要是按照ISO10993標準所規定的生物安全性評價方法進行的，按照GB/T 16886.3的要求，作為植入類材料骨水泥必須按照相關安全性檢驗標準進行完整生物學評價[1-3]。其中體外細胞毒性實驗是評價材料生物相容性最基礎、最經濟便利的步驟。它可以快速、方便地了解細胞和受試材料接觸后發生的生長抑制、死亡等反應，在評價生物相容性方面得到廣泛認同。

在本次試驗中，浸提原液中含慶大霉素的骨水泥及不含抗生素的骨水泥都表現出輕微細胞毒性，50%稀釋液都為極輕的細胞毒性，均在GB-T 14233.2-2005的可接受范圍內。由于MMA單體是造成細胞毒性的主要因素[4]，所以在制備骨水泥的過程中一定要注意攪拌均勻，充分放熱后再進行浸提，以免影響試驗的準確性。本試驗表明抗生素對骨水泥的細胞毒性并沒有產生太大的影響，兩種骨水泥與細胞的相容性較好，符合生物醫用材料的基本要求[3]。

參考文獻：

[1]醫療器械生物學評價[S].第5部分：體外細胞毒性試驗，2003

[2]醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法[S].第2部分：生物學試驗方法，2005