細胞增殖論文精品(七篇)

序論：寫作是一種深度的自我表達。它要求我們深入探索自己的思想和情感，挖掘那些隱藏在內心深處的真相，好投稿為您帶來了七篇細胞增殖論文范文，愿它們成為您寫作過程中的靈感催化劑，助力您的創作。

篇(1)

【關鍵詞】人乳鐵蛋白；癌細胞；細胞增殖

人乳鐵蛋白(HumanLactoferrin，hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白，乳汁別是初乳中含量最高，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用。國外有學者將其應用于腫瘤患者的治療，但是對其作用機制的研究較少。目前國內較少有關于hLF作用于細胞的報道，我們選用易早期轉移的鼻咽癌(NPC)細胞作為研究對象，以中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、人肝臟細胞(L02)作為正常細胞對照，觀察hLF在體外是否具有抑制癌細胞生長的作用，探討hLF抗腫瘤的作用機制，從而為腫瘤的治療提供研究基礎，為臨床實驗及應用提供新的理論依據。

一、材料與方法

1.1材料人鼻咽癌細胞(CNE)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、人肝臟細胞(L02)均購自中國科學院上海細胞資源中心。重組hLF(Lot:L0520，溶于PBS中，儲存濃度5mg/ml，-20℃儲存備用)和噻唑藍(MTT，Lot:M2128)均購自Sigma公司。RPMI1640、胎牛血清購自HyClone公司。其他試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養各細胞系均應用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640培養基，5%CO2，37℃培養。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖設空白對照組和hLF干預組。待細胞生長至對數生長期，接種于96孔細胞培養板，接種數為5×104/孔。每組細胞設5個平行孔，各組細胞分別加入不同濃度的hLF(0，1.25×10-3,2.5×10-3，5×10-3，10×10-3，20×10-3，40×10-3g/L)，每孔均為200μl。作用24h后，加入MTT(5g/L，每孔20μl)，繼續培養4h，測定A570nm吸光度。

1.2.3細胞形態觀察細胞經hLF處理后，傾去上層懸浮死細胞并用PBS洗兩遍，加入新鮮培養基。同樣處理對照孔細胞，將細胞置于倒置顯微鏡下，觀察細胞形態的變化。

1.3統計學處理數據用x±s表示，組間比較用方差分析。

二、結果

2.1重組hLF對鼻咽癌細胞CNE、人肝臟細胞L02、中國倉鼠細胞CHO系的增殖能力的影響對CNE呈現劑量依賴性的抑制作用，而對正常細胞無抑制作用。人乳鐵蛋白對各細胞體外增殖的影響與空白對照比較:1)P<0.05

2.2細胞形態學觀察顯微鏡鏡下可見，空白對照組癌細胞密集成片生長，如鋪路卵石狀，細胞膜圓潤，透明，顆粒較少，細胞間界限清楚，并可隱約見到細胞核。hLF處理組癌細胞形態發生明顯的改變，隨hLF濃度增加，細胞從正常的增殖旺盛的貼壁生長，逐漸表現為生長緩慢，黏附力降低，細胞變圓，細胞胞質粗糙，細胞內顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差，細胞形態完整性受損，而正常細胞在細胞鏡檢圖hLF作用下無顯著變化。

三、討論

hLF多種生物學功能通過免疫系統的激活與調節得以實現。Bezaul研究發現，乳鐵蛋白能抑制鼠實體瘤的生長和轉移。腫瘤內注射LF，可以明顯的減小實體瘤的體積，且作用效果與LF干預天數相關。研究發現，乳鐵蛋白的抗頭頸部腫瘤作用是通過抑制腫瘤細胞增殖實現的。Wolf等發現，人乳鐵蛋白通過阻斷頭頸部腫瘤細胞由G0到G1期的轉化來抑制腫瘤細胞的增殖。人乳鐵蛋白對鼠的SCC細胞系生長的抑制作用，與劑量成正相關；而且人乳鐵蛋白抑制頭頸部細胞癌的作用是通過直接的細胞毒作用及系統性的免疫調節作用實現的。

Varadhachary等人做了大量的口服臨床試驗，證實乳鐵蛋白無藥物相關的有害作用。鼻咽癌作為頭頸部腫瘤之一，其惡性程度較高，早期即可出現頸部淋巴結轉移，臨床上有轉移至骨盆、肺、肝等多器官的病例。選用鼻咽癌細胞作為研究對象，具有一定的代表意義。

本研究結果顯示，人乳鐵蛋白可以抑制鼻咽癌細胞增殖，且呈劑量依賴性，對正常細胞的增殖無明顯抑制作用。這一結果，為開發乳鐵蛋白的抗癌功效提供了理論依據。

【參考文獻】

篇(2)

MAPK信號通路在多種惡性腫瘤（包括卵巢癌）細胞的增殖、凋亡和化療藥物作用及化療藥物耐受發生中起重要作用[4-6]。MAPK家族包括p38 MAPK、細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多個亞家族。這些亞族組成多條信號通路，其中最主要的有P38途徑、ERK1/2途徑和JNK途徑。MAPK家族成員被磷酸化激活后，將細胞外的各種刺激信號傳遞到細胞內，引起細胞內級聯反應，調節細胞的增殖、凋亡及對藥物的敏感性[7]。有研究發現激活的AKT和MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，進而削弱鉑類和紫杉烷的促進細胞凋亡作用[8]。筆者前期研究發現MAPK信號通路在晚期上皮性卵巢癌組織中異常激活，并發現磷酸化p38 MAPK在耐藥卵巢癌組織中表達較非耐藥卵巢癌組織中升高。

二甲雙胍是一種用于治療2型糖尿病的雙胍類降糖藥，最近兩項大型流行病學調查研究表明：長期服用二甲雙胍能夠降低卵巢癌的發病率，而且二甲雙胍能夠顯著延長卵巢癌合并糖尿病患者的無進展生存期[9]。二甲雙胍通過STK11（也稱LKB1）激活AMPK，激活過程涉及多個參與細胞增殖調節的信號通路，其中包括MAPK信號通路[10]。但二甲雙胍是否能夠增加化療藥物對卵巢癌細胞的敏感性及相關的作用機制研究尚屬空白。

本研究首先觀察二甲雙胍對卵巢癌細胞增殖的影響，以及二甲雙胍是否可增強順鉑的化療敏感性，并通過檢測二甲雙胍對化療藥物相關的重要信號通路MAPK信號通路的調節作用來探討相關的作用機制。以期尋找能提高卵巢癌化療敏感性的新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑 人卵巢漿液性狀囊腺癌細胞系SKOV3，中、高分化，貼壁生長，購于中國醫學科學院細胞庫，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞系常規3～5 d傳代。兔抗人p38 MAPK多克隆抗體、兔抗人P-p38 MAPK單克隆抗體；兔抗人AMPK多克隆抗體、兔抗人P-AMPK單克隆抗體，兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Cell signaling公司；二甲雙胍、順鉑購自美國Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；Western blotting檢測試劑盒購自武漢博士德公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司；BrdU標記及檢測試劑盒購自德國Roche公司。

1.2 方法

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行處理，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍抑制卵巢癌細胞增殖的情況 二甲雙胍能夠抑制卵巢癌細胞增殖，并且這種抑制作用能夠被Compound C所削弱。隨著二甲雙胍濃度（1×10-3 mol/L，1×10-4 mol/L，1×10-5 mol/L）的增加，其對卵巢癌細胞SKOV3增殖的抑制作用逐漸增強（*P<0.05，**P<0.01）。其中1×10-4 mol/L

和1×10-5 mol/L的二甲雙胍能夠顯著抑制子宮內膜癌細胞的生長。而AMPK阻斷劑Compound C（5×10-7 mol/L，1×10-6 mol/L）均可削弱二甲雙胍的這種抑制卵巢癌細胞增殖的作用。1×10-6 mol/L Compound C與二甲雙胍聯合應用，其對卵巢癌細胞增殖的抑制作用與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖1。

2.2 二甲雙胍能夠增強卵巢癌對順鉑的敏感性 將不同濃度的順鉑（1、2、4、6 ng/L）加入卵巢癌細胞SKOV3中，加入或者不加入0.1 mM二甲雙胍孵育細胞48 h后，結果表明：0.1 mM的二甲雙胍聯合順鉑（1、2、4、6 ng/mL）作用于卵巢癌細胞時，順鉑抑制卵巢癌細胞生長的作用顯著增強（P<0.05）。其中6 ng/mL順鉑聯合0.1 mM的二甲雙胍對卵巢癌細胞的抑制作用最顯著（P<0.05），見圖2。

2.3 二甲雙胍聯合p38 MAPK阻斷劑SB203580能夠增強二甲雙胍的抗卵巢癌細胞增殖的作用 單獨應用SB203580（5[dylw.net提供專業寫作論文和服務.]、10 ?M）能抑制卵巢癌SKOV3的增殖，差異有統計學意義（P<0.05）。二甲雙胍（0.1 mM）和SB203580（5、10 ?M）聯合應用對卵巢癌細胞SKOV3增殖的抑制作用顯著增強（*P<0.05，**P<0.01）。其中0.1 mM二甲雙胍與10 ?M p38 MAPK阻斷劑SB203580聯合應用對卵巢癌細胞SKOV3增殖的抑制作用最顯著（**P<0.01），見圖3。

2.4 二甲雙胍激活AMPK信號通路，并抑制MAPK信號通路 二甲雙胍（10、20 mM）作用卵巢癌細胞SKOV3 6 h后，磷酸化AMPK水平顯著增高，且升高的磷酸化AMPK水平能夠被AMPK阻斷劑Compound C所削弱。經二甲雙胍（1、10 mM）處理后，卵巢癌細胞SKOV3中磷酸化p38 MAPK蛋白水平顯著降低，見圖4。

3 討論

最近兩項大型流行病學資料顯示：（1）長期服用二甲雙胍可降低卵巢癌的發病風險；（2）在合并糖尿病的卵巢癌患者中，服用二甲雙胍的患者較未服用患者的無病進展存活率顯著增加[10-11]。筆者研究結果發現，二甲雙胍能夠抑制卵巢癌細胞增殖，這種作用是通過激活AMPK信號通路實現的。AMP激活蛋白激酶（AMPK）是主要的細胞能量調節器，是代謝和腫瘤互相作用的主要調節子[11]。二甲雙胍以一種非胰島素介導的方式直接調節細胞增殖和凋亡，二甲雙胍通過激活AMPK，激活的AMPK調節多個信號通路，其中包括mTOR和MAPK信號通路，最終調節細胞增殖和凋亡。

化療藥物引起的細胞損傷主要是通過、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路實現的，并且化療藥物耐受的形成也與MAPK信號通路激活密切相關[6]。MAPK家族包括P38MAPK、細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多個亞家族。這些亞族組成多條信號通路，其中最主要的有P38途徑、ERK1/2途徑。MAPK信號通路在多種惡性腫瘤（包括卵巢癌）細胞的增殖、凋亡和化療耐藥產生過程中發揮重要作用[6]。MAPK家族成員被磷酸化激活后，將細胞外的各種刺激信號傳遞到細胞內，引起細胞內級聯反應。有研究發現激活的MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，進而削弱鉑類和紫杉烷的促進細胞凋亡作用，使腫瘤細胞對化療藥物產生抵抗[12]。筆者的研 究結果表明：二甲雙胍可能通過激活AMPK信號通路，進而抑制MAPK信號通路來抑制卵巢癌細胞增殖的。這與以上研究結果相一致。

筆者的研究結果還發現：二甲雙胍（0.1 mM）能夠增強順鉑抑制卵巢癌細胞增殖作用。與最近的幾項研究結果一致：二甲雙胍能改善乳腺癌化療耐藥，并且發現二甲雙胍的這種對化療耐藥的調節作用是通過激活AMPK實現的[13]。Tseng等[16]在非小細胞肺癌細胞中發現二甲雙胍不僅能夠降低紫杉醇誘導p38 MAPK介導的切除修補基因（ERCC1）的表達，還能夠增加紫杉醇誘導的細胞毒效應。另外在肺癌、乳腺癌和前列腺癌裸鼠體內模型中，二甲雙胍能夠顯著增強順鉑、紫杉醇和多柔比星對腫瘤細胞生長的抑制作用，并且二甲雙胍能夠減少多柔比星的用量，延長疾病緩解期[14-15]。但這些結果說明二甲雙胍可能通過激活AMPK調節腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。

筆者同時發現，二甲雙胍聯合MAPK信號通路抑制劑能夠增強二甲雙胍的抗腫瘤作用。p38 MAPK、p42 MAPK信號通路抑制劑可增加二甲雙胍和紫杉醇的抗腫瘤作用[16]。Liu等[17]在乳腺癌中發現二甲雙胍和mTOR抑制劑（RAD001）聯合可增強化療藥物的細胞毒作用，聯合應用二甲雙胍、化療藥物和mTOR阻斷劑能夠[dylw.net提供專業寫作論文和服務.]協同抑制乳腺癌細胞增殖。Monteagudo等[18]在前列腺癌細胞中，p42 MAPK siRNA能夠顯著增強二甲雙胍的抗腫瘤作用。因此，鉑、紫杉醇化療的基礎上聯合二甲雙胍和信號通路阻斷劑可能會增強卵巢癌化療的療效，這些研究結果都與筆者的研究結果一致。

總之，二甲雙胍能夠提高卵巢癌細胞系SKOV3細胞對順鉑的敏感性，并且這種作用是依賴于AMPK激活的；p38 MAPK阻斷劑SB203580也能夠抑制SKOV3的增殖，二甲雙胍能夠增強這種抑制作用。二甲雙胍的這種增強卵巢癌細胞對順鉑敏感性的作用可能是通過激活AMPK，從而抑制MAPK信號通路實現的。筆者的研究結果為臨床應用二甲雙胍及MAPK信號通道阻斷劑來提高卵巢癌化療藥物的敏感性提供理論支持，為卵巢癌的臨床聯合用藥提供新思路。

參考文獻

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篇(3)

論文摘要 目的：探討糖尿病足中醫辨證分型與血管細胞核增殖相關抗原的表達差異。方法：對32例截肢的糖尿病足患者按中醫辨證分為氣血兩虛瘀阻證、脈絡瘀熱證、脈絡熱毒證和氣陰兩虛瘀阻證，分別對其截肢肢體的脛后動脈應用免疫組化法對細胞核增殖相關抗原（Ki67）的表達進行觀察、分析。結果：Ki67的陽性表達與糖尿病足動脈硬化閉塞程度呈負相關，與血管炎癥病變程度呈正相關。結論：炎癥在糖尿癥的大血管病變的過程中起到了重要的作用。

糠尿病足是糖尿病的嚴重并發癥，據統計1996年全球糖尿病患者1．2億，預計到2025年，將達到2．5億以上，而大約15％的糖尿病患者將在其生活的某一時間發生足潰瘍或壞疽[1]。目前對于糖尿病足病因及發病機制雖然還不是完全清楚，但大家公認糖尿病合并大血管病變導致動脈粥樣硬化是糖尿病足發病的最主要因素?，F將2004年10月～2005年5月間我們收治的32例糖尿病足患者的截肢動脈標本的血管細胞核增殖相關抗原(Ki67)與其中醫辨證分型的相關性研究情況報告如下。

1 臨床資料

1．1 一般資料：32例均為天津醫科大學代謝病醫院和天津中醫學院第一附屬醫院2004年10月～2005年5月間的住院患者，其中男性24例，女性8例；年齡50～86歲，平均年齡69．2歲；糖尿病病程最長30年，最短6年，平均18±2．4年。

1．2 診斷標準：糖尿病足的診斷標準采用2000年中華醫學會糖尿病學會第二屆糖尿病足會議所制訂的“糖尿病足(肢端壞疽)檢查方法及診斷標準”。

1．3 截肢標準：參照國際糖尿病足工作組編寫的《糖尿病足國際共識》中關于“大截肢的定義、標準和指標”[2]執行。

1．4 中醫辨證分型標準：參照《中醫外科學(第七版)》及《中藥新藥臨床研究指導原則·脫疽》之中醫辨證分型方案分為氣陰兩虛瘀阻證、脈絡瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證四型。

2 觀察方法

2．1 標本取材：壞疽截肢標本32例，其中按中醫辨證分型氣血兩虛瘀阻組10例，脈絡瘀熱組10例，氣陰兩虛瘀阻組4例，脈絡熱毒組8例，取各例標本下肢脛后動脈。標本經過10％福爾馬林固定，常規石蠟包埋，備用。

2．2 設備、試劑：美國PENGUIN-600CL自動圖像分析系統，細胞核增殖相關抗原(Ki67)抗體PV9000試劑盒DAB購于北京中山生物技術有限公司。

2．3 免疫組織化學法：標本常規石蠟包埋，4μm連續切片，采用PV法進行免疫組化染色，染色過程嚴格按試劑盒染色程序進行，選取已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。觀察細胞核增殖相關抗原(Ki67)，陽性物質呈棕黃色細顆粒狀于細胞核表達，采用美國PENGUIN-600CL圖像分析系統進行圖像分析，選取病變處每500個細胞Ki67的陽性表達率作為其陽性表達指數。統計學處理應用SPSS10．0軟件包進行方差分析。

3 結果

3．1 中醫各證型所占比例以及年齡、性別分布：各證型比例，氣血兩虛瘀阻組10例（31．25%），脈絡瘀熱組10

例（31．25%），氣陰兩虛瘀阻組4例（12．5%），脈絡熱毒組8例（25．0%）。年齡、性別分布情況，見表1。

表1 32例患者年齡、性別分布 n（%）

性別n50~60歲61~70歲71~80歲80歲以上男24（ 75．0）4（12．5） 8（25．0）11（34．4）1（3．1）女 8（ 25．0）1（ 3．1） 3（ 9．3） 4（12．5）0 總計32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2 免疫組織化學法觀察各證型Ki67表達差異：具體情況見表2。

表2 各證型Ki67陽性表達指數比較 （%）

證型Ki67陽性表達指數脈絡熱毒 4．87±1．01*氣陰兩虛瘀阻1．86±0．47脈絡瘀熱1．49±0．13氣血兩虛瘀阻0．30±0．18注：與氣血兩虛瘀阻型比較，*P

氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證、脈絡瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中均可見部分細胞Ki67呈陽性表達，在脈絡熱毒證中表達指數最高，氣血兩虛瘀阻證中表達指數最低，二者比較具有顯著性差異(P

4 討論

Ki67抗原為細胞核內與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，分子量為345kd和395kd，其編碼基因位于第10號染色體上。Ki67的表達出現于G1中期到晚期，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達高峰，分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇，到G0期則不表達，半衰期為lh或更短[3]。有人認為它可能是具有蛋白結合特性的重要結構，在有絲分裂中起著維持DNA規則結構的重要作用[4]，是一個反映細胞增殖的敏感指標。

在糖尿病足的不同辨證分型中氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證、脈絡瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中Ki67表達均呈陽性，在脈絡熱毒證中表達最強、氣血兩虛瘀阻證中表達最弱，二者相比具有顯著性差異(P＜0．05)。根據Ki67陽性指數可以判斷細胞增殖的活性，指明細胞增殖與糖尿病足動脈病變的關系。在糖尿病足的不同辨證分型中動脈的硬化閉塞程度由輕到重依次是脈絡熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證、脈絡瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證。Ki67的陽性表達與糖尿病足動脈硬化閉塞程度呈負相關。而在通過對32例糖尿病足截肢的動脈進行病理學觀察的過程中發現糖尿病足血管病變主要體現在中動脈的病理學變化，其中脈絡熱毒、氣陰兩虛瘀阻兩證型以動脈周圍及全層的炎癥性改變為主；脈絡瘀熱、氣血兩虛瘀阻證以中膜鈣化、平滑肌細胞萎縮、變性、壞死及膠原纖維增多及內膜粥樣斑塊形成為主，炎癥表現不明顯；而Ki67的陽性指數與血管炎癥病變程度呈正相關。這說明炎癥在糖尿病的大血管病變的過程中起了重要的作用，特別是在脈絡熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證兩型，這對臨床具有重要的指導意義。

5 參考文獻

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2 許樟榮，敬華．糖尿病足國際共識．中華糖尿病學會第二屆足病第一次足病研討會．2002，435．

篇(4)

關鍵詞：醇提物、細胞毒、MKN-28、SMMC-7721

中圖分類號：R9694文獻標識碼：A

文章編號：1007-2349（2013）02-0048-02

惡性腫瘤嚴重的威脅著人類生命和健康，其發病率和死亡率在世界許多國家和地區居首位。據WHO預測，到2020年全球腫瘤發病率將上升50%，癌癥病人將增加的近1500萬，惡性腫瘤將成為21世紀危害人類健康的頭號殺手。目前已上市的抗腫瘤藥物缺乏細胞毒性特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，往往無選擇地殺傷正常細胞，特別是增生活躍的造血干細胞，正常細胞的損傷常導致嚴重的并發癥，影響治療效果和患者依從性。而近年來，從天然藥物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物成為研究熱點[1]。

景洪哥納香系蕃荔枝科哥納香屬植物，全世界約50種，分布于熱帶及亞熱帶地區[2]。我國產10種，分布于西南、華南、臺灣等省區。在民間主要用于清熱、殺蟲、抗癌、抗瘧等[3]。筆者通過體外觀察景洪哥納香醇提物對兩株人腫瘤細胞株的抗增殖作用，初步判斷其抗腫瘤活性。為將景洪哥納香抗腫瘤活性的進一步研究提供必要的前期基礎。

1材料與方法

11材料人胃癌細胞MKN-28、人肝癌細胞SMMC-7721購自于中國科學院上海細胞庫；RMPI-1640培養基購自于GIBCO公司；新生牛血清購自于杭州四季青試劑公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）購自于Sigma公司；三聯液（10mL SDS，5mL異丁醇，012mL HCL，定容至100mL）由實驗室自己配置。注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素購自于大連美羅大藥廠。

12細胞培養用RPMI-1640培養液含10%新生牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素，在37 ℃、5 %的二氧化碳培養箱中常規培養，25 g/L胰酶+02 g/L EDTA消化傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

13體外抗增殖作用采用改良MTT法，取對數生長期的細胞，以4×104/mL、90 μL /孔接種于96孔板中，分別加入陰性對照組生理鹽水（NS）、陽性對照組（終濃度為01、1、10 μg/mL的順鉑）及終濃度分別為1、3、10、30、100 μg/mL的各種景洪哥納香醇提物，每個濃度均設4個平行孔，于37℃、5%CO2培養箱內培養48 h，每孔加入5 g/ L MTT 10 μL，振蕩混勻，4h后，每孔加入100 μL三聯液，12 h后，輕輕振蕩15 min，在酶標儀上于490 nm/570 nm雙波長下測定OD值，計算細胞增殖抑制率：

細胞抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%

并利用Gwbasic軟件計算半數抑制濃度（IC50）。

2結果

21形態學觀察不同濃度的景洪哥納香醇提物用于兩種人腫瘤細胞48h后，光學顯微鏡下觀察可見細胞增殖被顯著抑制（見圖1、圖2）。高濃度景洪哥納香醇提物與正常組比較，細胞貼壁能力下降，由不規則形狀逐漸變圓、皺縮、折光性降低，細胞數量顯著減少，可見大量細胞碎片。且發現景洪哥納香醇提物對兩株人腫瘤細胞增殖抑制能力有一定的劑量依賴性。

22體外細胞增殖抑制作用改良MTT法觀察景洪哥納香醇提物對細胞的細胞毒作用，發現景洪哥納香醇提物在一定的劑量范圍內，可以顯著的抑制MKN-28細胞的增殖能力，且具有顯著的劑量依賴性，其IC50為3102μg/mL。而其對SMMC-7721同樣具有顯著的細胞毒作用，但是劑量依賴性不明顯，其IC50為1888μg/mL。觀察發現，100μg/mL景洪哥納香醇提物對這兩株人腫瘤細胞增殖抑制率可達95%以上。隨著濃度的降低，其細胞毒作用也逐漸降低。（見圖3）

3討論

中醫藥在治療癌癥方面有其獨到之處。近年來，從中藥中篩選抗癌活性成分以及抗癌先導化合物已成為這一領域研究的熱點。據不完全統計，來源于植物藥的抗癌制劑，占總抗癌藥的1/3左右[4]。紫杉醇、喜樹堿、長春新堿等已作為許多腫瘤的首選藥。我國的藥用植物種質資源豐富，如果能將中藥中抗腫瘤有效成分分離出來，明確其抗腫瘤作用及機理，對于抗腫瘤藥物的研制開發以及腫瘤治療具有非常重要的意義。[JP]

番荔枝科屬植物抗腫瘤活性顯著，在上世紀90年代就被多位國內外學者所關注[5]。景洪哥納香是番荔枝科哥納香屬植物，其抗腫瘤活性近年也開始引起學者的關注[6]。筆者對景洪哥納香的醇提物在體外進行了初步細胞毒活性測試，光學顯微鏡下觀察發現景洪哥納香醇提物高濃度時可以顯著抑制細胞增殖，且發現大量細胞碎片，提示筆者其抗MKN-28增殖作用的機制可能是直接殺死細胞，而不僅僅是誘導細胞凋亡。改良MTT法研究發現其抗腫瘤活性顯著，且具有一定的劑量依賴性。提示筆者可以進一步觀察其對其它人腫瘤細胞株細胞毒作用如何、以及其細胞毒活性是否存在時間依賴性及其抗腫瘤機制。

筆者通過體外觀察兩株人腫瘤細胞體外實驗，對景洪哥納香醇提物抗腫瘤活性進行初探，以期為景洪哥納香的抗腫瘤活性研究提供必要的前期基礎。[KH*1D]

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篇(5)

【關鍵詞】 神經干細胞

［摘要］回顧國內外有關阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）與神經干細胞（neural stem cell， NSC）關系的文獻，結合針刺治療AD的實驗研究成果，提出針刺原位誘導AD海馬內源性NSC的增殖分化，可能是針刺治療AD的作用機制，為進一步研究針刺治療AD提供了新的思路和方向。

［關鍵詞］阿爾茨海默病; 神經干細胞; 針刺療法

Pondering insitu induction of endogenous neural stem cells in hippocampus of rats with Alzheimer disease by acupuncture

ABSTRACT Analysis of domestic and overseas literature on the relationship between Alzheimer disease (AD) and neural stem cells (NSC) shows that inducing the proliferation and differentiation of hippocampal endogenous NSC insitu by acupuncture is probably the mechanism of acupuncture therapy in treating AD， and that it may further improve the method for the research on AD.

KEY WORDS Alzheimer disease; neural stem cell; acupuncture therapy

阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）是一種神經退行性疾病。其特征性病理變化為：淀粉樣蛋白沉積、神經元纖維纏結、基底前腦和海馬區的神經元數目減少，并以海馬區受累最為嚴重，神經元平均減少達47%［1］。目前全世界有2 000～2 500萬AD患者，2050年將超過3 000萬［2］，我國的AD患者已超過500萬。有專家估計，我國用于治療AD患者的費用，每年至少需50億，到2050年，預期費用將超過10 000億［2］。因此，防治AD已成為全社會高度關注的問題。

1AD的神經干細胞修復策略

有研究認為，神經干細胞（neural stem cell， NSC）將為AD的治療帶來革命性的前景［3～6］。早在2001年，在美國國立衛生研究院向美國國會呈遞的干細胞科學研究總結性報告中就指出：神經系統疾病的干細胞研究是極少的有證據顯示能用細胞替換療法修復神經喪失功能的研究領域之一［7］。NSC的修復方法主要有兩種。一是在實驗室里，將未分化的神經細胞培養為適合移植到患者體內的已分化細胞。方法是在種植前就把這些細胞進行培養，使其向所需的已分化神經細胞的方向分化，或者直接把它們種植到體內，由體內的信號來引導它們分化成熟為合適的腦細胞，即外源性移植。但這種方法主要存在免疫排斥、倫理道德以及胚胎來源有限等問題。另一種修復方法是依靠生長激素和其他營養因子（生長因子、激素）以及其他可以幫助細胞存活并生長的信號分子，通過激活患者自己的干細胞和體內的修復機制來修復由疾病或損傷引起的損害，也即內源性原位誘導。這一修復方法已經成為AD等神經變性疾病NSC研究的熱點［8～10］，它不僅可成為補償或替代丟失的海馬神經元的新策略，還可以完全避免外源性NSC移植所帶來的一系列問題。

2AD的神經干細胞修復研究思路

研究發現，AD病變自身存在內源性NSC的增殖活化。在正常成年個體，內源性NSC主要存在于環繞側腦室的大腦室下帶、紋狀體、海馬等部位。正常情況下它們處于靜止狀態，在疾病或某些生長因子的刺激下能被誘導、活化，以替代疾病中缺乏的神經細胞［11～13］。在國外，Jin 等［14，15］研究了AD病變與NSC增殖活化之間的關系。他們以AD患者腦組織作為研究對象，發現在AD患者的海馬組織中，與NSC增殖分化相關的蛋白標志物doublecortin、多唾液酸神經元黏附分子、TUC4（TOAD/Ulip/CRMP）和微管相關蛋白（microtubule associated protein， MAP）均呈現高表達；接著他們以轉基因小鼠AD模型進行研究，發現在靜息NSC集中的兩個區域，即環繞側腦室的大腦室下帶和海馬齒狀回顆粒下層均有NSC的增殖活化。在國內，金國華等［16～18］以切斷穹隆海馬傘作為AD模型，研究結果表明：穹隆海馬傘切斷后第7天時，MAP陽性神經元較多，胞體大、突起長，第14天時細胞進一步遷移、成熟；正常組第7天時僅見少量突起短的MAP陽性神經元，第14天時細胞稍增多，突起稍增長；對照組第7天時未見MAP陽性神經元，第14天時僅有少量胞體小、突起短的MAP陽性神經元；而且，穹隆海馬傘切割側的海馬提取液可明顯促進NSC分化為神經元和膽堿能陽性神經元。這些研究表明：AD病變自身可作為一種刺激原，誘導內源性NSC增殖活化。但AD病變后內源性NSC的增殖活化對AD病變是有利還是有害呢？研究發現，給予NSC增殖活化的特異性抑制劑甲基氧化偶氮甲醇（methylazoxymethanol， MAM）后，不僅NSC的增殖活化受到抑制，同時學習記憶能力亦下降［19，20］。提示：AD病變后內源性NSC的增殖活化是機體實現自身修復的一種潛力。但是為什么AD仍呈進行性發展呢？有研究認為，除了與增殖分化的速度慢于凋亡的速度有關外，還與機體存在抑制NSC增殖分化的因素有關［14，15］。

加強促進NSC增殖分化的因素或解除抑制NSC增殖分化的因素，都將有利于AD患者海馬內源性NSC的增殖分化，實現AD的治療效應。周思朗等［21］從增加神經營養類物質以促進原位誘導內源性NSC增殖分化的角度，采用前腦Meynert基底核注射紅藻氨酸形成的AD模型，每天予以側腦室注射堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），7 d后發現，室管膜下區及海馬齒狀回代表NSC的溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine， BrdU）陽性細胞明顯增加，提示bFGF可促進AD模型大鼠腦內NSC的增殖分化；同時，AD模型大鼠的學習記憶能力亦有所改善。此外，對表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）［22］、腦源性神經營養因子［23，24］、血管內皮生長因子［25］和胰島素樣生長因子1［26］等的研究也獲得了類似的結果。一些學者則從抑制NSC增殖分化因素的角度進行研究，結果發現：海馬齒狀回內骨形態發生蛋白及其受體的高水平表達，是抑制海馬NSC增殖分化的關鍵因素［27～29］。抑制內源性noggin蛋白的表達，可使NSC增殖分化降低，同時學習記憶能力下降［30］；給予側腦室注射外源性noggin蛋白，可拮抗骨形態發生蛋白4，促進NSC增殖分化，增強學習記憶能力［31，32］。此外，給予EGF和FGF或兩種以上物質進行聯合注射，亦可獲得類似的結果［33］。雖然動物腦內注射實驗已取得了很好的療效，但要在臨床推廣應用仍存在難以長期堅持的問題。聯合注射的療效可能更好，但究竟如何進行聯合，目前尚無明確的答案。

3神經干細胞修復研究的針刺介入

臨床研究［34~36］表明：針刺治療AD主要在于改善認知和學習記憶的能力。在其作用機制的研究方面，已經進行了針刺治療AD的行為學、神經遞質（乙酰膽堿、興奮性氨基酸等）、血漿一氧化氮、細胞因子、血清β淀粉樣蛋白、生長因子、突觸可塑性和信號傳導［37～45］等多方面的研究，但尚無應用針刺原位誘導內源性NSC進行AD治療的作用機制研究的相關報道。但針刺原位誘導AD海馬內源性NSC具有其自身的優勢和極大的可行性。在自身優勢方面，針刺療法的作用原理不是從外部向機體增加物質，而是充分調動機體自身的內在潛力，發揮治療和調整效應，這樣可以避免NSC外源性移植或注射誘導所帶來的倫理道德、免疫排斥以及難于長期堅持等問題。其次，有研究發現［46］，外源性給予兩種或兩種以上的某些物質進行聯合誘導，效應會是1＋1＞2，但哪些物質進行聯合誘導效應最佳，尚未有明確的結論。目前公認，針刺療法具有綜合性、整體性、雙向性等自身調整的特點和優勢，可以從多環節、多途徑進行調整。它既可能增強NSC增殖活化的因素，也可能解除抑制NSC增殖活化的因素，從而發揮最大的誘導效應。針刺原位誘導除了有自身的優勢外，還有極大的可行性。首先是間接依據方面，目前針刺對脊髓損傷、腦梗死和帕金森病后NSC作用的研究已取得部分成果。Cui等［47］制作大鼠脊髓損傷模型后，行督脈電針，1次/d，電針7 d后，檢測NSC增殖和分化標記物nestin的表達。結果顯示：在督脈電針后第7、14、21和28天，nestin的表達均增加，且增加的nestin陽性細胞數與神經功能改善相平行。李常新等［48］研究表明：電針可通過干預腦內內源性NSC的變化促進腦梗死的恢復。電針治療不僅可促進室管膜下層、病灶周圍及海馬NSC的增生，促進急性期新生神經元的增多，還可使病灶周圍、遷移流動帶處及海馬移行細胞及移行的NSC增多，增加移行的新生神經元。我們在已完成的“電針對帕金森小鼠NSC多巴胺神經元突觸形態與功能可塑性影響的研究”中發現，針刺可誘導黑質致密部內源性腦源性神經營養因子［49］和NSC標記物nestin的表達，促進NSC的增殖、分化，從而促進突觸可塑性的發揮。這些研究結果為針刺原位誘導AD海馬NSC的可能性提供了間接的依據。在直接依據方面，我們在已結題的“電針促進老年癡呆大鼠海馬神經元突觸可塑性的影響及機制”的研究中發現，電針可以誘導老年癡呆大鼠海馬內源性神經生長因子、一氧化氮和cfos的表達，從而增強海馬殘存神經元形態的可塑性，發揮其代償功能［43］；同時，與學習記憶密切相關的海馬膽堿能神經元陽性數目增多，乙酰膽堿轉移酶活性增強。結合Calza 等［50］的研究發現，神經生長因子可以誘導海馬NSC定向分化為膽堿能神經元，我們認為：針刺療法極有可能是通過增強海馬內源性神經生長因子的表達，促進了海馬內源性NSC的增殖活化，并定向分化形成新生的膽堿能神經元。如果能作進一步的深入研究，將會為針刺治療AD作用機制的研究提供新的思路和方向。

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篇(6)

論文關鍵詞：基因治療,移植靜脈,再狹窄

隨著醫療水平的發展，像靜脈移植等手術方法治療包括冠狀動脈在內的血管狹窄等疾病給病人生活帶來新的希望，但術后通暢率逐年下降又給病人帶來新的憂慮。目前對預防移植靜脈再狹窄主要手段有放射、藥物、物理治療，雖然有一定成效，但效果還是不佳，隨著生物科學技術的發展，人們將希望寄托于基因治療。下面將對基因治療中目的基因和載體的選擇進展進行綜述。

1.目的基因的種類靜脈橋再狹窄主要機制就是內皮細胞的損傷；血栓形成；平滑肌細胞的遷移和增殖。這為我們目的基因的選擇提供依據。

1.1促進內皮細胞修復的基因。

1.1.1內皮型一氧化氮合酶(eNOS)一氧化氮（NO）是體內重要的生物信使分子和效應分子，它具有抑制vsmc增殖、遷移，抑制血小板聚集等功能。而eNOS是NO合成的關鍵酶，通過將eNOS基因局部轉移，是防止移植血管狹窄的有效手段。王曉明等通過給靜脈橋轉染帶有eNOS基因的復制缺陷型重組腺病毒，再旁路移植到動脈后得出其加速內皮細胞再生、抑制血栓形成，進而抑制內膜增生。

1.1.2血管內皮生長因子(VEGF)VEGF能高效的刺激內皮細胞的增殖，使損傷的內皮盡快得到修復，也可以間接抑制血管平滑肌細胞遷移和增殖。VEGF165是最主要的異構體，是其生物學作用的主要形式，也是目前的基因治療中主要選用的異構體。有研究表明通過腺病毒介導的VEGF過度表達可以使球囊損傷的動脈內皮細胞再生，抑制血管內膜增殖。

1.1.3肝細胞生長因子(HGF):HGF是一種間質細胞衍生的多功能細胞因子，能刺激血管內皮細胞分裂和增殖,促進血管內皮細胞損傷的修復，但不引起VSMC的增殖。有研究表明轉染HGF基因可增強球囊損傷后血管內皮組細胞的功能，有效抑制損傷血管的狹窄。

1.2抗血栓形成的基因。

1.2.1組織因子途徑抑制物(TFPI)TFPI是相對穩定的糖蛋白，是廣譜的Kunitz類型絲氨酸蛋白酶抑制物，其具有很強的抗凝作用。有研究表明通過腺病毒介導TFPI基因局部轉染可以顯著抑制PICA術后血栓形成和內膜增厚，主要是通過促進血管平滑肌細胞（VSMC）凋亡而抑制血管的狹窄的。

1.2.2組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)t-PA纖溶酶原激活劑主要物質之一，主要有血管內皮細胞合成。其主要功能就是裂解纖溶酶原肽鍵，形成具有活性的纖溶酶。Ross報道t-PA減少能使經皮冠狀動脈成形術(PTcA)后血管狹窄,可見t-PA在預防血管狹窄中起到比較重要的作用。t-PA不僅能預防血管狹窄，有項研究也表明tPA基因逆轉錄病毒載體直接注入介入手術后再狹窄動物模型的血管壁可以減輕狹窄面積，甚至能達到30%。

1.3抑制VSMC增殖遷移的基因。

自體移植靜脈再狹窄的主要病理特征為內膜顯著增厚。增厚內膜主要是由血管平滑肌細胞增殖、遷移等因素形成，其中有很多調節步驟參與當中。這為我們抑制VSMC增殖、遷移提供許多候選基因。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是一種能使無活性的核昔類似物輕甲基無環鳥苷轉化為磷酸化的細胞毒性形式，誘導DNA鏈合成中止引起細胞死亡。實驗研究表明HSV-tk基因能抑制新生內膜形成、降低內膜面積與中膜面積的比值(I：M)。FAS是一種凋亡受體，在VSMC中表達較多，當FAS配體在血管壁上表達也可以降低新生內膜的形成。抗細胞遷移金屬基質蛋白酶(MMPs)基因在VSMC的遷移中有十分重要的作用,組織型金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)及其同家族成員都有顯著減低I:M比例.

1.4聯合基因治療

由于預防移植靜脈狹窄干預靶點太多,而誰是關鍵基因尚未確定,又加上單一靶點效果并不理想,于是有人聯合多個基因進行干預,證明比單一基因干預更有效。Gunn等用C-myb的反義核酸得出能抑制豬經皮冠狀動脈成形術后的內膜增生.VanBelle等在兔股動脈上給予VEGF165質粒可以加速內皮化,減少附壁血栓和新生內膜形成。張鐵民等實驗顯示,反義寡核苷酸與VEGF聯合應用較兩者單用更能顯著預防再狹窄。

2.載體的種類為了獲得一個好的臨床治療效果，載體的選擇是重要的一步。載體就是將目的基因導入特殊部位的工具，通常分為病毒載體和非病毒載體，它們各有自己的優缺點。

2.1病毒載體的種類

2.1.1腺病毒載體腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，目前的腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎。腺病毒主要優點有轉染細胞廣泛、攜帶的DNA量大、感染效率高、重組病毒滴度高、不整合到宿主細胞、理化性質穩定等。以腺病毒介導的基因治療預防血管狹窄的研究層出不窮。體內轉基因表達時間短暫、病毒基因表達的產物引起的毒性反應限制腺病毒這個載體的應用。正因如此，對腺病毒載體的改進正在進行，如經RGD-4C整合素靶向多肽改良后的腺病毒在靜脈橋中有更好的轉染能力

2.1.2腺相關病毒載體（rAAV）rAAV源于非致病的野生型腺相關病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣、免疫源性低，在體內表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉移載體之一。

通用的AAV載體都是基于血清型2，即AAV2。因為rAAV感染效率低、制備成本高且只能包裝小于4.7kb的基因序列而在基因治療中受到限制。

2.1.3慢病毒載體慢病毒載體（LVs）是在HIV-1病毒基礎上改造而成的病毒載體系統，它能高效的將目的基因導入動物和人的原代細胞或細胞系。LVs具有免疫原性低、整合到細胞上長期表達、可感染非分裂期與分裂期細胞等優點.已有研究表明慢病毒載體應用于球囊損傷致血管狹窄研究的可行性。但慢病毒仍具有潛在的產生復制型慢病毒（RCL）和致癌的風險，相關的研究還是有待加強。

2.2非病毒載體非病毒載體是通過哺乳細胞攝取和細胞間轉運大分子物質的機制來把目的基因轉入靶器官。雖然非病毒載體具有安全、易得、無免疫源性等優點，但是他們基本上轉染效率不高，因此早期在基因治療研究中沒有太高的地位。隨著技術的進步，非病毒載體在基因治療載體選擇上占有一定份額，尤其表現在納米粒子、超聲微泡載體上。

2.2.1超聲微泡載體：它的作用原理是通過超聲的物理效應使細胞膜上產生可逆的小孔，借助此孔外源性物質進入細胞內。Taniyama等通過超聲微泡載體將p53的cDNA轉入球囊損傷大鼠頸動脈，得出血管內膜和中膜面積的比值顯著降低。雖然超聲微泡靶向釋放技術的靶向性及無創性的優點已達到大部分實驗的認可，但其轉染效率不高仍是需要大力研究的。

2.2.2納米粒子：它是現在研究比較熱門一種非病毒載體，主要是可以使被包裹的目的基因免受水解酶的降解，將目的基因運載到血管平滑肌上，達到治療疾病的目的。胡新華等通過納米粒子介導的反義雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因抑制移植靜脈內膜增生得出納米粒子在血管狹窄治療中是可行的?，F在用的納米粒子主要是PLGA，它有很好的組織相容性，產物沒有任何毒性。

3.總結和展望

這些年來盡管科研及醫務工作者在移植靜脈獲取技術、藥物防治、應用血管外支架和放射治療等方面做了大量的工作并在預防移植靜脈再狹窄上取得一定成效，但是總體效果還是不理想。移植后的靜脈因為內皮細胞損傷、炎性細胞浸潤、平滑肌細胞遷移增殖、細胞外基質增加等一系列病理改變導致移植靜脈再狹窄。隨著分子生物學技術的發展，安全、高效的載體出現、多基因聯合等綜合治療必將能有效預防血管再狹窄。

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篇(7)

1 材料和方法

1.1 試劑

ACC高轉移株ACCM、低轉移株ACC2由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。Trizol試劑盒（Life Technologies公司，美國），逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒（TaKaRa公司，日本），MMP9抗體、山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶復合物及顯色劑DAB抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（Bioworld Technology公司，美國），磷酸化表皮生長因子受體（phospho-rylation epidermal growth factor receptor，P-EGFR）、磷酸化細胞外信號調節激酶（phosphorylation extra-cellular signal-regulated kinase，P-ERK）、KGF抗體（Abcam公司，美國）。過氧化物酶標記的二抗及增強化學發光底物（Millipore公司，美國）。

1.2 細胞培養

ACC細胞培養：在RPMI 1640、10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1鏈霉素培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育，細胞傳代采用0.25%胰蛋白酶消化細胞。細胞生長至70%～80%用于后續實驗。

1.3 實驗分組

取對數期生長的ACC2接種于培養面積為25 cm2的細胞培養瓶中，設定壓力強度為103.74 kPa，根據加壓時間不同將實驗組分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組。另外將加壓培養的ACC2設置為陰性對照組，未加壓培養的ACCM設置為陽性對照組。

1.4 免疫組織化學法半定量檢測EGFR的表達

將密度為5×104個·mL-1的細胞懸液滴于爬片中央，待細胞貼壁后，在孔板內追加培養基，孵育過夜，于103.74 kPa加壓3、6、12、24 h后，棄去細胞培養基，4%多聚甲醛固定15 min。所有的細胞爬片均按免疫ABC法進行檢測。3%過氧化氫液37 ℃孵育20 min阻斷內源性過氧化物酶；羊血清37 ℃封閉30 min；滴加EGFR抗體4 ℃過夜，次日37 ℃復溫1 h；二抗37 ℃孵育30 min；辣根過氧化物酶復合物37 ℃ 30 min，DAB顯示1 min。設立空白對照：兔血清代替一抗；陰性對照：PBS代替一抗。顯微鏡下細胞膜及細胞漿內出現棕色顆粒即為EGFR表達陽性。

1.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase poly-merase chain reaction，RT-PCR）法檢測MMP9和EGFR mRNA的表達取各組細胞，以Trizol試劑盒方法提取總RNA，取等量RNA進行逆轉錄反應，合成cDNA，經Taq-DNA聚合酶作用擴增目標基因MMP9、EGFR、GAPDH。以GAPDH為內參，分析MMP9和EGFR基因的mRNA水平。以未加壓組基因的表達量為基線，分析各處理組表達量的改變。MMP9引物序列：5’TCCAGTAGACAATCCTTGCAATGTG3’（正義鏈），5’CTC-CGTGATTCGAGAACTTCCAATA3’（反義鏈）；EGFR引物序列：5’GAGTAACAAGCTCACGCAG-TTG3’（正義鏈），5’GAGGAC ATAACCAGCCA-CCTC3’（反義鏈）；GAPDH引物序列：5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC3’（正義鏈），5’GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT3’（反義鏈）。

1.6 Western blot法檢測相關蛋白表達

取對數期生長的細胞，以PBS清洗，加入細胞裂解混合液后，將細胞刮下，14 000 r·min-1離心15 min，取上清并[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]行蛋白含量測定。加入等體積5×SDS-PAGE上樣緩沖液，置沸水浴中加熱10 min。樣本在10% SDS-PAGE凝膠中電泳，電壓100 V。電泳完成后濕轉或半干PVDF膜上，再將此膜于4 ℃封閉過夜。次日按Western blot試劑盒說明書，利用抗人MMP9、EGFR、P-EGFR、KGF、P-ERK單抗進行抗原抗體結合反應和化學發光實驗。

2 結果

2.1 加壓環境對細胞內EGFR表達的影響

免疫組織化學檢測結果表明：陰性對照組ACC2低表達EGFR，隨著加壓時間延長，實驗組EGFR表達逐漸增加，整體呈時間正相關性，加壓12 h后達到最大，與陽性對照組ACCM的表達接近（圖1）。

Western blot檢測結果表明：1）與陰性對照組相比，實驗組EGFR的表達量在加壓3 h后達到峰值，超過了陽性對照組中EGFR蛋白表達量，但是其蛋白表達量并未隨著加壓時間延長而逐步增加，在加壓24 h后降至與陰性對照組相似水平。盡管EGFR的表達量未體現出明顯的時間相關性，但在加壓后，總蛋白的表達量仍有明顯的上調。2）實驗組P-EGFR的表達量呈時間正相關性，隨著加壓時間的延長，P-EGFR蛋白表達量逐漸增長，并在加壓24 h后達到峰值，而陽性對照組及陰性對照組中P-EGFR均為低表達（圖2）。

2.2 加壓環境對MMP9和EGFR mRNA表達的影響

RT-PCR法檢測結果表明：MMP-9和EGFR mRNA的表達量在加壓6 h開始上 調，在加壓24 h達到最大，表達量整體表現出時間正相關性。MMP-9加壓24 h后其表達量是陰性對照組的3.8倍，EGFR加壓24 h其表達量是陰性對照組的4.5倍（圖3）。

2.3 壓力刺激對轉移黏附相關蛋白的影響

Western blot檢測結果表明：實驗組隨著加壓時間的延長，MMP9、KGF、P-ERK蛋白的表達量均逐漸增加。MMP9及P-ERK的表達量在加壓6 h后明顯增加，加壓24 h后略有降低；KGF的表達量與時間呈正相關，蛋白表達量在加壓24 h后達到最大。陰性對照組的MMP9、KGF、P-ERK均低表達。

3 討論

為了驗證腫瘤微環境能與各種基因相互作用，本研究采用免疫組織化學技術半定量檢測不同加壓時間對EGFR表達的影響，結果顯示ACC2細胞在間質液壓升高的情況下上調EGFR表達量。為了更準確地證明間質液壓的升高可以影響EGFR蛋白水平的表達，本研究還采用Western blot方法檢測了EGFR及P-EGFR的表達情況，結果也證實了腫瘤微環境中間質液壓與ACC2中蛋白表達改變的相關性。

MMP9與細胞侵襲遷移能力相關，且ACC細胞的侵襲性與加壓時間呈正相關性[7]。本實驗中檢測了MMP9的mRNA及蛋白表達量，RT-PCR結果顯示IFP的升高可從mRNA水平上調MMP9基因的表達，從而改變細胞的生物學行為，進一步證實了腫瘤微環境在腫瘤發生發展中的重要作用；然而蛋白水平的檢測結果卻是在加壓環境中MMP9的蛋白表達量并未隨時間延長而逐步增加，僅在加壓6 h及12 h后出現了表達高峰。筆者推測，在ACC中可能還存在其他的與侵襲轉移相關的分子。研究認為：P-ERK的上調與ACC肺轉移存在密切關系[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]，KGF是與腺樣囊性癌密切相關的黏附相關分子，加之腫瘤微環境中IFP的升高也為腫瘤細胞轉移提供了有利環境[4，8-9]。在本實驗中筆者檢測了加壓環境中P-ERK及KGF在ACC中的表達情況。Western blot結果在一定程度上證實了這兩種蛋白的表達量隨著加壓時間的延長而逐步增加。這就為加壓環境中腺樣囊性癌侵襲轉移能力增加提供了分子基礎。同時蛋白水平的檢測也證實了EGFR及P-EGFR的表達量隨著環境的改變而改變。這一結果表明腫瘤微環境可與腫瘤細胞相互作用，改變細胞的生物學行為。隨著IFP的升高，細胞內與惡性表型相關的基因及蛋白表達量增加，為ACC2侵襲轉移提供了分子基礎。

IFP的升高與調控血管生成的基因相關，降低其表達或者改善間質流體動力學可早期降低IFP，從而利于常規放化療的進行[4]。血管內皮生長因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ）、丙酮酸脫氫酶激酶1等基因產物可改變血管的滲透性，降低間質液壓，改善細胞外酸化和缺氧，從而克服腫瘤微環境成為治療屏障這一問題[10]。趨化因子受體CXCR4與腺樣囊性癌的組織學類型及轉移潛能呈正相關性。在高壓環境下黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及Src的激活有利于直腸癌細胞的黏附。那么IFP的升高會影響ACC細胞的黏附能力嗎？能否解釋ACC的極易復發、早期轉移以及神經侵襲性的生物學行為呢？因此在今后的實驗中，將繼續檢測與血管相關的分子（如血小板-內皮細胞黏附分子、VEGF-A、VEGF-C及組織纖維蛋白溶酶原激活劑以及Src等）在加壓環境中表達量是否改變，進一步建立體內模型；并且，利用VEGF抑制劑、CAⅨ以及丙酮酸脫氫酶激酶1的基因產物來改善腫瘤微環境中升高的間質液壓，觀察ACC的生物學行為以及上述指標的表達情況，為腫瘤治療提供理論依據。

綜上所述，本實驗表明，腫瘤微環境中間質液壓的升高可從mRNA及蛋白水平兩方面影響MMP9、KGF、P-ERK的表達，從而調控細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力。

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