醫學技術論文精品(七篇)

序論：寫作是一種深度的自我表達。它要求我們深入探索自己的思想和情感，挖掘那些隱藏在內心深處的真相，好投稿為您帶來了七篇醫學技術論文范文，愿它們成為您寫作過程中的靈感催化劑，助力您的創作。

篇(1)

優勢和特點

1)親和力高、特異性強。適配體與靶標之間，憑借彼此互補的三維結構，相互作用后形成牢固穩定的復合物，其解離常數通常能達到pmol/L～nmol/L的水平，并且能分辨出靶標結構上細微的差別。

2)庫容量大，識別范圍廣泛。SELEX技術的靶標遠遠多于經典的抗原抗體結合反應，除了有蛋白質、核苷酸分子外，還可以是糖類、氨基酸、維生素、抗生素、金屬離子、有機染料，甚至可以是細菌、病毒、寄生蟲等完整的細胞或組織，幾乎囊括了自然界中的全部物質。

3)合成容易，獲得方便，易于修飾。適配體的體積比傳統抗體小，篩選過程簡便、周期短，對實驗室的要求不高，并具備自動化控制的巨大潛力。經過化學合成和修飾以后可保持原生物活性不變，還可以增強其穩定性并增加其他新的化學性質，參加多類反應。標記了熒光、生物素和納米金顆粒之后，發展出了諸如分子成像技術等疾病診斷新方法。

4)重復性好，純度高。整個篩選和制備的過程在人為控制之下，所得到的適配體幾乎沒有生產批次之間的差異，便于日后的大規模生產和應用。的化學性質更穩定，不易降解，對溫度不敏感，保存時間長，即使變形也能在很短的時間內復性，利于室溫下運輸。

5)分子量小、穩定性高。相對于抗體或酶，適配體的化學性質更穩定，不易降解，對溫度不敏感，保存時間長，即使變形也能在很短的時間內復性，利于室溫下運輸。

6)應用便捷。SELEX技術所獲得的適配體又被稱作是核酸型抗體，其優于傳統抗體的性質是沒有免疫原性，因此便能獲得一些低免疫原性甚至無免疫原性靶分子的適配體。并且還省去了傳統抗體制備過程中的動物實驗，而直接從體外文庫中獲取。而且適配體更容易通過細胞膜，并且沒有毒性，利于檢測細胞內的靶分子和實現多層次的調控，并能較快地被機體清除代謝掉，經過特定的化學修飾后，還可使半衰期延長，穩定性提高，便于科學研究和疾病診治。

2SELEX技術的發展

目前SELEX技術出現了一些新的篩選方法，越來越多的與各種標靶相對應的適配體被篩選出來。如毛細管電泳法、硝酸纖維素膜過濾法、磁珠分離法、親和色譜法、Non-SELEX技術、無引物PCR-SELEX技術、微流體SELEX技術、生物芯片SELEX技術、原子力顯微鏡等各種新的模式也被應用到適配體的篩選中。同時還出現了SELEX技術與定量PCR，SEL-EX技術與流式細胞儀、SELEX技術與ELISA的聯合應用，更是極大的提升了篩選的效率和準確性。

2．1消減SELEX技術消減

SELEX技術是一種經過改良的SELEX技術。以完整細胞為靶標的消減SELEX技術，是在篩選過程中以完整的細胞作為靶標，并消減掉能與已知或未知的共有靶標結合的配體，經過消減后的次級隨機文庫再投入到特異靶標的篩選中。它的意義在于可以實現從兩組高度同源的完整細胞中，篩選出針對其中一種細胞的特異性適配體。這項技術可應用于發現新的腫瘤細胞識別結構，還可進一步作為“生物導彈”，獨立完成靶向治療或攜帶藥物，未來將會在腫瘤的治療中發揮巨大的功效。

2．2自動化SELEX技術

傳統的SELEX技術過程需要完成一套重復繁瑣的操作，使得篩選相對耗時耗力。自動化SELEX技術的建立可以簡化篩選過程，節約時間和物品的消耗，實現高通量和限定范圍，達到同時篩選多個靶分子的效果。自動化SELEX技術離不開現代分離儀器的配合，后者的發展推動了前者的進步。2001年Cox等使用Biomek2000自動化工作站成功篩選到了溶菌酶的特異性適配體，通過這種自動化篩選平臺，不到2d就完成了12輪的篩選。

2．3導向SELEX技術

適配體的特異性是整個SELEX技術的核心所在，為了提高適配體的特異性和穩定性，可將已知的能與靶標非特異結合的分子摻入到文庫中或預先與靶標進行混合后再篩選，這樣可獲得只與靶標特異結合的適配體。2002年Hamm等將此技術與抗個體基因型的方法聯合運用，成功獲得了特定激酶抑制劑的特異性RNA適配體。Martell運用特殊的導向SELEX技術，從隨機表達盒雜交文庫中篩選到了能與E2F蛋白具有高親和性的RNA適配體。

3SELEX技術在醫學中的應用

3．1SELEX技術在基礎醫學研究中的應用

依據核酸適配體具有與靶物質高特異性結合的能力，可以幫助我們尋找到疾病的發病機制。Roulet等提出把SELEX技術同基因表達串行分析手段聯合應用，并通過自動化的序列提取工藝，建立轉錄因子結合位點的定位模型。通過對轉錄因子適配體文庫中的某一序列進行測序，可了解該蛋白結合位點的特異性，探尋一些以前在基因組中從未研究過的結合位點，掌握在不同的核苷酸位點上非獨立堿基出現的先后順序，為闡明其結合機制提供一些線索。Bian-chi等采取SELEX技術發現，TRF1二聚體在端粒上有兩個相同的識別半位點，它們的距離可以變化，且兩個半位點的順序方向沒有區別。這為探索端粒長度的調節機制提供了新依據。

3．2SELEX技術在疾病診斷中的應用

腫瘤細胞及其標志物的早期檢測對于腫瘤的診斷及預后極為重要，目前已經篩選出多種腫瘤的特異性適配體，例如急性髓系白血病的適配體KH1C12、急性淋巴細胞白血病的適配體sgc8/sgc3/sgd3、惡性膠質瘤的適配體GBI-10、Burrkitt淋巴瘤的適配體TD05、非小細胞肺癌的適配體S1/S11e/S15、小細胞肺癌的適配體HCA12/HCC03/HCH07/HCH01、乳腺癌的適配體KMF2-1a、結腸癌的適配體KDED2/KD-ED7/KDED9/KC2D3、小鼠肝癌的適配體TLS9a/TLS11a、卵巢癌的適配體DOV3/DOV4/DOV6。它們可以特異地識別腫瘤細胞，僅需少量腫瘤細胞即可實現準確的鑒別和分型。將適配體與納米顆粒結合后通過比色檢測，觀察顏色的變化即可判斷有無靶標細胞。這個實驗非常敏感，樣本中的靶細胞數超過百個即可檢測出來，還不需要昂貴的檢測設備和待檢靶標的標記與修飾。因此，有可能成為常規篩查活體標本中新生腫瘤細胞的一種新方案。與此同時腫瘤細胞的分子成像技術也已經問世，它能夠從細胞水平對生物過程進行可視化描述及測量，不僅能定位病灶，觀察某些影響腫瘤細胞行為的生物過程，還能觀察腫瘤細胞對藥物的反應。Kim等研究將前列腺特異性膜抗原(PSMA)的特異性適配體與金納米材料結合后，帶有PSMA的前列腺癌細胞便能夠被特異性地標記出來，將其作為造影劑應用在前列腺腫瘤的影像學診斷中，比傳統的造影劑顯像時間更持久，毒副作用更小，應用價值更顯著。SELEX技術還在血液的生化檢查方面，顯示出一定的應用前景。用其檢測血液中的某些靶分子，將比傳統方法更特異和高效。腦尿鈉肽(BNP)常被臨床上用來評價急性心力衰竭或急性呼吸窘迫癥患者的病情和預后。Lin等采用SELEX技術的原理，篩選到了能與BNP特異結合的適配體。在微流體試驗模式下，被熒光標記的適配體可以快速測出血液中BNP的濃度，比放射免疫分析法或是免疫分析技術更精確、更經濟。C反應蛋白(CRP)是機體在應激狀態下生成的一種非特異性的急性時相反應蛋白，CRP與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病具相關性。Bini等開發出了一種帶有光化學性質的CRP特異性適配體，當血液中的CRP濃度超0．005mg/L時就能被檢測出來，敏感度非常高。這一成果為新型CRP診斷試劑的研制奠定了基礎。SELEX技術還被應用在病原微生物的檢測，其能克服傳統檢測方法在特異性和敏感性上的缺陷，為新型檢測試劑盒的開發提供有力支持。例如結合分支桿菌的特異性適配體CSRI2．11檢測過程比傳統的培養鑒定法更省時更敏感;丙型肝炎病毒的適配體ZE2可結合酶聯免疫吸附試驗實現丙型肝炎的早期篩查，不受抗體檢測時窗口期的制約;瘧原蟲乳酸脫氫酶的適配體PL1在臨床實踐中，可以很好的區分患者是否感染了出間日瘧原蟲或惡性瘧原蟲。

3．3SELEX技術在疾病治療中的應用

SELEX技術在疾病治療中的功效越來越來受到人們的重視。適配體在體內與靶分子結合，理論上可以對靶分子的生理功能和代謝過程產生影響，靶分子也會因此發生信號傳導的改變甚至喪失原本的功能，直接或間接阻斷疾病發生進程。以此開發的靶蛋白功能阻斷劑，日益顯示出其巨大的潛力。全球首個適配體藥物是2004年由美國食品和藥物管理局批準上市的哌加他尼鈉，可用來治療老年性黃斑變性。SELEX技術在凝血系統疾病的治療上具有一定的意義，已找到了可用作抗凝血和抗血栓藥物的適配體REG-1，其結合的位點是凝血酶的肝素結合位點以及纖維蛋白原結合位點。在治療免疫系統疾病方面，也已獲得了具有藥物開發潛力的特異性適配體，如可用來拮抗自身抗體已達到治療系統性紅斑狼瘡的適配體，還有能刺激T細胞釋放的4-1BB的適配體。對于腫瘤的治療，基于SELEX技術研制的適配體藥物更是走在前列，進入到了臨床試驗階段。如對實體瘤和復發性急性髓樣白血病有良好療效的AS1411，更出現了連接金納米棒的適配體，用作腫瘤靶向光熱治療。適配體藥物作為抗病毒藥，也展現出良好的前景，比如用來抑制狂犬病病毒的復制和干擾艾滋病病毒的體內合成。除此以外，核酸適配體還可作為運輸工具，特異性地把藥物運送至靶標細胞或組織達到定點清除的治療效果，研究比較成熟的有裝載著阿霉素，用來殺傷前列腺癌細胞的復合適配體藥物。

4展望

篇(2)

(1)醫學教學需要用到大量的大幅掛圖，在教學時攜帶大量的大幅掛圖不方便，現場繪制即浪費時間又不能準確真實表述出圖的內容。

(2)“粉筆+黑板”的教學模式，由于教學手段單一、呆板，課堂氣氛死板、沉悶，不利于激發學生的想象力和創造力，學生的聽課積極性不高，教師的創造性思維也受到了抑制，容易使教師因循守舊、不思改進，一本教案用幾年，以至知識老化，創造性思維枯竭。

(3)醫學教學素材眾多，難以長期保存。

(4)醫學知識繁瑣、復雜，課堂上老師苦于難把大量的知識傳授于大家，多數老師一味填鴨式的講授，不僅不會增加學生學習的效率，還會使學生產生厭煩情緒。學習資源和信息。

2多媒體技術在醫學教學中的重要性

(1)計算機多媒體技術把枯燥無味的知識形象、滿足不同學生的不同需要，使得學生在一定時間內盡可能獲取更多的知識。

(2)多媒體技術可以節省板書時間，大大提高了課堂效率，還可以增加與老師溝通互動的機會。

(3)多媒體技術的應用改變了傳統醫學教學過程單調枯燥的局面，完全可以在課下依靠網絡加強學習，而且多媒體技術實現了資源的共享，為學生提供了更多的

3多媒體教學在醫學教學中應注意的事項

多媒體教學在醫學教學中產生了重大的變革，但是，應用多媒體時，應將多媒體作為教學的助力，不能成為教學的絆腳石。所以，使用多媒體技術時，應注意以下幾個方面。

(1)避免遏制學生的想象力。這就造成教師在課堂上過多的進行電腦操作，引導學生按照課件的指示進行學習，在一定程度上抑制了學生的想象力。

(2)避免重回填鴨式教學。多媒體技術的廣泛應用使教師的板書量大大減少，造成學生沒有足夠的時間進行思考，導致教師無法全面的掌握學生學習的具體情況，對于教學中存在的問題不能及時發現和改正。

(3)避免過度依賴多媒體教學，使教師學生之間失去互動性。學生也不會再認真地去做筆記，整理自己的學習思路和知識體系，而是變得更愿意去依賴拷貝教師的教學資料。

4結論

篇(3)

AP－PCR基本原理與常規PCR類似，均為引物指導下的DNA擴增，同樣包括變性、退火、延伸的基本步驟，其不同之處在于普通PCR使用的是序列特異性引物而AP－PCR過程中的引物是10個左右非特異性寡聚核苷酸鏈（隨機引物）。AP－PCR之所以能進行是因為在反應過程中引物和模板并不需要完全的匹配，在較低的退火溫度下，只要引物的一部分特別是3′端有3～4個以上堿基與模板（DNA或RNA反轉錄的cDNA）互補復性且方向正確，距離在一定長度范圍內，在TaqDNA聚合酶的作用下就可擴增出一定長度的DN段，利用多個隨機引物可使檢測區域擴大至整個基因組（Babu等，2014）。擴增后的產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，核酸染料或放射性自顯影得到DNA指紋圖譜，從而分析比較其多態性或進一步克隆分析（Babu等，2014）。

2、AP－PCR的技術方法和優缺點

2．1模板DNA提取和質量檢測

模板DNA提取的方法有很多，應根據組織的不同和試驗需要確定，但其基本的原理相同，都是通過酶或有機試劑裂解組織使核酸游離出來，然后通過有機溶劑或吸附柱純化后提取。核酸的濃度和質量可通過UV分光光度計讀取D260nm與D280nm的比值和1％瓊脂糖凝膠電泳等檢測來確定（Mohini等，2011）。目前已有很多商品化的核酸提取試劑盒可供選擇，使用方便并可得到較高質量的模板（DNA或cDNA）。

2．2隨機引物的選擇

隨機引物長度通常為10個堿基，GC的含量為60％～80％的寡聚核苷酸鏈，隨機引物不僅核苷酸的排列順序是隨機的，而且所有引物的序列無直接相關性（韋莉萍，2001）。理論上，如果1條隨機引物反應可產生x個獨立的條帶，那么a條隨機引物同時參與反應就可得到xa2個條帶，但多條引物同時參與反應會相應的增加結果的復雜性和不穩定性（Nandani等，2014）。隨機引物雖然可用于所有物種，但并不是所有的隨機引物擴增出來的結果都有意義，想要得到較為理想的結果仍需根據研究對象和研究目的進行引物的篩選和反應條件的優化，一般來說選擇能產生中等復雜度的圖譜的引物（Nandani等，2014）。

2．3AP－PCR擴增條件

AP－PCR也包括變性、退火、延伸的經典PCR過程。變性過程在94℃進行，一般來說預變性3～5min；退火溫度在35～38℃，也可根據引物Tm值來確定，一般退火溫度比引物Tm值低3～5℃；延伸溫度在72℃，在此溫度下Taq酶的合成效率約為2000bp／min（Kumari等，2013）。AP－PCR的試驗條件、模板的質量和濃度及反應體系中Mg2＋的濃度等都可能對擴增的結果產生影響，想要得到較為理想的試驗結果，反應體系的優化和試驗操作的標準化是非常重要的（Mohini等，2011；Kumari等，2013；Babu等，2014）。

2．4AP－PCR的優點

AP－PCR延續了PCR的效率高、靈敏度高、樣品用量少等優點，同時又兼有自身的優點：①不同種類的生物樣品即可使用通用的隨機引物進行基因分析（Welsh等，1991）；②可在對研究對象不了解的情況下進行基因多態性分析，從而對研究對象進行遺傳分析和分類研究（Williams等，1990；Welsh等，1991）；③對于研究對象DNA樣品量有限的情況也適用（Nandani等，2014）；④隨機引物易獲得，試驗成本低，技術容易掌握，除此之外，可對AP－PCR產生的基因條帶進行純化和克隆，以便進一步分析（Ge等，2014）。

2．5AP－PCR的局限性

AP－PCR雖然具有很多獨特的優勢，但目前仍處于應用的探索階段，其本身仍有局限性：①AP－PCR技術通常是對顯性基因標記進行分析，這就意味著不能將純合子與雜合子區別開（Babu等，2014）；②由于無明確的目的序列，如果發生擴增條帶的缺失就無法得知是什么原因導致的，不利于對擴增結果的分析（Kumari等，2013）；③AP－PCR的結果分析需要專業的帶譜分析知識，否則很難從結果中得到有意義的信息；④AP－PCR結果的重復性問題一直是限制其廣泛應用的主要原因，由于其結果受DNA模板的質量、反應體系成分和反應條件的變化等因素的影響，其擴增產物的穩定性難以控制（Mohini等，2011）；⑤AP－PCR結果通過凝膠電泳來觀察，但遷移率相同的譜帶的核苷酸同源型不明等情形易造成干擾，有時電泳遷移率相同的片段并非同源，這就給結果分析帶來很多不確定性（Nandani等，2014）。

3、AP－PCR技術研究進展

3．1AP－PCR技術自身的優化

近年來，不斷有研究者對AP－PCR技術進行改進和優化，使其更具可操作性、實用性和更廣泛的應用領域。劉剛等（2004）對AP－PCR進行了優化，建立了多重隨機引物PCR（M－RAPD）技術，M－RAPD通過使用3條組合的隨機引物在較高的退火溫度下對肺炎鏈球菌、糞腸球菌和大腸埃希菌耐藥菌株等的染色體DNA進行擴增獲得了穩定的種株特異性的DNA指紋圖，其所提供的基因信息要遠多于傳統的RAPD技術。Xiong等（2012）對AP－PCR進行了反應程序優化和隨機引物中G／（G＋C）不同比例研究，結果表明，反應程序中從退火步驟到延伸步驟的時間延長，溫度變化由3℃／s下降到0．3℃／s時，PCR產物條帶明顯增加，這可能是由于延長溫度變化的時間可提高引物與模板結合的穩定性（Fu等，2000），在比較了隨機引物中G／（G＋C）不同比例的PCR產物后發現，當G／（G＋C）比例在0．7時PCR產物的條帶最多，也更適用于進行AP－PCR反應，因此反應程序的溫度變化和隨機引物中G／（G＋C）的比例可能也是影響AP－PCR結果的重要因素。Zou等（2003）報道了利用兩步AP－PCR方法在微量DNA樣品中擴增未知序列DNA并進行克隆。第1步PCR利用29個核苷酸序列的引物進行擴增，Ran5－29（5′－GTTCTACACGAGTCACTGCA－GNNNNNNNTGGC－3′），這一隨機引物包括21個已知核苷酸序列部分，7個隨機核苷酸序列和1個3′端TGGC的卡子結構，在隨機序列前6個核苷酸序列構成了1個PstⅠ位點，其中3′端卡子結構在退火時可與含有GCCA位點結合，保證了隨機序列可與GCCA上游的序列匹配，3′端TGGC的卡子結構可使引物與模板的匹配數增加7～11個核苷酸，PstⅠ位點決定PCR產物的長度，并保留1個黏性末端，保證了克隆的順利進行。第2步PCR使用可與Ran5－29相匹配的19個核苷酸的Fix5－29（5′－GTTCTACACGAGTCACTGC－3′）作為引物，獲得的產物進行純化、克隆分析。結果表明這種策略可檢測臨床樣本DNA的最小量在1pg，克隆靈敏度達到100fg目的DNA模板。這種方法較普通AP－PCR靈敏度更高，適用于樣本量極少的臨床樣品檢測。Clem等（2007）在對比了AP－PCR方法的不同擴增策略，在此基礎上建立一種快速有效的檢測不明病原的多重隨機RT－PCR方法。在對血液樣本進行過濾后加入了DNase和RNase消化，利用宿主基因對DNase和RNase敏感而衣殼保護的病毒對其不敏感的特點，去除宿主自身基因的污染。其利用單一十聚核苷酸為引物，引物序列為（V8A2）5′－VVVVVVVVAA－3′，V＝A、G或C，3′2個A提供了一個“lock”結構，引物中不含有胸腺嘧啶脫氧核苷酸（T）可避免發生引物二聚體，但這一結構不可避免的會影響引物與模板的結合。試驗結果一旦監測到病毒的擴增產物即可通過鳥槍法克隆測序鑒定。這一方法對病毒的出現或重組進行快速監測和鑒定有很強的實用性，其檢測靈敏度達到1000克隆／mL，應用這一技術成功從血液樣品中檢測并獲得了3種獨立病毒的部分序列。

3．2以AP－PCR為基礎衍生的分子生物學技術

隨著分子生物學技術的發展，單一的AP－PCR技術已不能滿足研究的需要，因此為了克服AP－PCR的一些缺點在其基礎上衍生出包括非序列依賴單引物PCR（SISPA）、簡并核苷酸引物PCR（DOP－PCR）、DNA擴增指紋印記（DAF）、微衛星引物PCR（MP－PCR）等分子生物學技術。SISPA方法最早是由Reyes等（1991）建立起來的，其以AP－PCR為基礎，非對稱的單一引物與DNA模板的鈍末端直接連接，隨后經過若干循環的變性、退火和延伸后，模板的數量得到擴增，后經克隆、測序、分析得到基因序列。Breitbart等（2005）在SISPA的基礎上建立了DNase－SISPA聯用的方法，增加了樣品過濾和DNA酶消化等步驟，成功的從人的血液臨床樣品中發現了新的病毒基因。Djikeng等（2008）在已有研究基礎上進行了新的改進，在樣品的處理中加入RNase酶以清除外源RNA的污染如核糖體RNAs。針對有polyA尾的病毒，在反轉錄過程中加入六聚核苷酸隨機引物5′端加入一段病毒特異性引物序列，形成結合引物（FR26RV－N：5′－GCCGGAGCTCTGCAGATATC－NNNNNN－3′），同時加入連接polyT的引物（FR40RV－T：5′－GCCGGAGCTCTGCAGATATC－TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT－3′）以增加對病毒基因3′端的覆蓋率。這種在六聚體隨機引物連接一保守序列即病毒特異性引物，可增加對病毒基因5′的捕獲，從而使SISPA的成功率大大提高。DOP－PCR技術是在AP－PCR基礎上建立起來，其引物（DOP－ORI－Xho）由22個核苷酸組成，3′和5′端的特異核苷酸序列和中間的6個核苷酸構成的隨機引物組成（Telenius等，1992）。由于隨機引物的簡并性，每個反應包含著數以千對的引物。DOP－PCR的反應程序包含2個不同的部分，前5個循環引物的3′端至少有12個連續的核苷酸與模板DNA相結合，對引物和模板的匹配度要求不高，在隨后的30～40個循環里，擴增錯配的幾率會逐漸降低。初始反應產物將成為模板，用相同的引物進行擴增，擴增產物通過克隆測序即可獲得基因序列（韓燾等，2013）。Csaba等（2002）打破了DOP－PCR只用同一種引物的傳統，嘗試了5條新的可用于反應的引物，使反應時間由原來的7～8h縮短為2h，縮短了變性過程的時間，在取得理想結果的同時，減少了擴增酶的用量，提高了DOP－PCR的效率和實用性。DAF是一種改進的AP－PCR分析技術，與AP－PCR技術不同的是，DAF使用的引物濃度更高，長度更短（約5～8個堿基），在PCR反應上只包含2個溫度的循環，省去了延伸的步驟，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過銀染方法觀察結果。DAF通常會產生非常復雜的帶型，因此它所提供的譜帶信息也比AP－PCR大得多（Caetano－Anolles等，1993）。Al－hag等（2007）應用DAF鑒定8株細胞系，研究結果表明，DAF可產生穩定的可供區分的PCR譜帶。Ehsan等（2011）應用DAF技術對分離到的25株牛隱孢子蟲進行亞型的鑒定，結果發現分離的25個蟲株分屬于為3個不同的亞型。MP－PCR是以AP－PCR為基礎的分子標記技術。Ma等（1996）發現真核生物基因組中存在短串聯重復序列，又稱微衛星DNA或簡單重復序列（simplesequencerepeats，SSR）。真核生物基因組中SSR的分布是隨機的，大約每隔10～50kb就有1個SSR。SSR位點最常見是雙核苷酸重復，即（CA）n和（TG）n，每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單位數目10～60個。MP－PCR的引物是與SSR位點互補的二聚或三聚核苷酸重復序列，如其引物序列可是（TA）10或（CGA）6，擴增的是SSR之間不同長度的DNA序列，將擴增產物進行凝膠電泳，根據分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率（Dawson等，2013）。MP－PCR克服了AP－PCR引物的不確定性，增加了PCR產物譜帶的穩定性和針對性，該技術也已廣泛應用于物種分子標記、基因圖譜繪制和基因差異性分析等方面（Tian等，2014；Ding等，2014；Wei等，2014）。

3．3AP－PCR與其他分子生物學技術的聯用

擴增片段長度多態性（AFLP）技術是將基因組DNA先用限制性內切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DN段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點（Rikalainen，2013）。針對AP－PCR結果譜帶核苷酸同源性無法確定的缺點，Tan等（2011）將AP－PCR與AFLP進行聯用，利用2種方法各自的優勢，在對可能含有未知病原的臨床樣品進行檢測，以實驗室確診的登革1型病毒為陽性對照，首先用AP－PCR對有限的樣品基因進行隨機擴增，然后使用AFLP技術對進行擴增從而得到樣品穩定的DNA多態性標記。此方法克服了AP－PCR的同源性不明問題，同時比單獨使用的AFLP方法進行檢測的靈敏度提高100倍，在臨床樣品的檢測中有很大的實用價值。高通量的測序技術也被稱為下一代的測序技術，其與AP－PCR技術的配合使用，讓AP－PCR有了更廣闊的應用前景。Hang等（2012）首先使用錨定隨機引物P17N8（5′－GTTTCCCAGTAGGTCT－CNNNNNNNN－3′）進行RNA反轉錄，在通過錨定隨機引物P17N8和P21（5′－CGCCGTTTCCCAG－TAGGTCTC－3′）同時進行AP－PCR擴增，再通過高通量的測序技術對PCR產物進行測序，對得到的基因序列進行拼接處理，從而得到了奧羅普切病毒和卡拉帕魯病毒L片段完整基因序列。vanderHeij－den等（2012）利用序列非依賴性病毒基因片段擴增方法與Roche－454測序技術聯用，成功的從患急性肝炎病犬的肝臟組織檢測出犬Ⅰ型腺病毒基因，研究結果表明AP－PCR技術和下一代的測序技術聯合使用的方法在獲得病毒完整基因序列和檢測病原等方面的實用性。

4、AP－PCR技術在動物醫學中的應用

4．1在傳染病流行病學和病原遺傳學分類中的應用AP－PCR由于其獨特的技術優勢，在獸醫傳染病學和病原遺傳學分類中已得到廣泛應用。Leh－marn等（1992）用此技術對念珠菌屬的分離菌進行分析，試驗結果表明，同一菌種的不同菌型間呈現出DNA長度的多態性；此帶型圖在同一菌種的不同菌型間，其相似程度遠大于不同種的菌株，這也說明每種菌的隨機引物PCR帶型極具特征性。Louie等（1996）用2種引物檢查15株李斯特單核菌相關流行分離株和36株不相關流行分離株。經擴增后的帶型分析，將其分為9個型，每個型中又分有不同的亞型。Zadoks等（2000）在牛乳樣品中分離到23株金黃色葡萄球菌，經AP－PCR鑒定1～8株屬于Ⅰ型菌，9～20株屬于Ⅱ型菌，其余3株分別屬于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型菌。Butler等（2001）應用該技術對3次牛霉形體暴發流行菌株進行了檢測，結果表明，發生在其中2個養牛場的流行病原菌具有一致的指紋圖，引而具有相同的感染來源，而在另一牛場分離的菌株間則顯示了指紋圖譜的顯著異型性，說明它們具有多個感染來源。王雪敏等（2011）利用多組隨機引物對副雞禽桿菌10個國際標準株、血清C型疫苗株和4個國內分離株進行AP－PCR擴增，結果顯示，所有菌株可分為11個譜型，聚為4類。劃分的11個譜型可和現有分型方法中的不同亞型一一對應，提示這種方法可區分不同血清亞型。AP－PCR作為寄生蟲遺傳學分類鑒定的方法已得到廣泛應用，克服了傳統分類方法難以解決的問題。Macph－eson等（1993）應用AP－PCR技術區分來自不同宿主的7種艾美爾球蟲，結果表明選擇合適的引物可對7種球蟲進行鑒別。張偉信等（2003）應用該技術對雞柔嫩艾美耳球蟲不同地理株的多態性研究，結果表明不同地理株間及同一地理株親代與子代間均存在DNA多態性差異，其中不同地理株間種內變異程度較大，同一地理株子代與親代間也發生遺傳變異，但變異程度較小。

4．2在病原差異基因分析中的應用

AP－PCR技術進行RNA指紋圖譜分析不僅能鑒定基因的表達差異，而且能顯示低水平表達的基因差異。Nicho－las（2000）應用此方法鑒定了絲裂霉素C誘導下鼠傷寒沙門氏菌SOS調控基因表達的差異，結果表明，絲裂霉素C誘導后21條基因譜帶出現表達水平的上調，其中20個基因片段對應的是可辨識的基因序列，15個基因序列與數據庫中基因序列無同源性，被確定為新的表達序列，6個基因片段與SOS基因編碼的調控蛋白有關。Diana等（2005）應用AP－PCR技術對芐硝唑作用下克氏錐蟲基因表達差異多態性的研究，結果發現對芐硝唑敏感和對芐硝唑抵抗種群之間系統指紋圖譜存在一定的差異，其中可能存在克氏錐蟲對芐硝唑擁有抗性的表達機制，雖然抗性種群在芐硝唑作用下系統指紋圖譜沒有明顯的變化，但敏感種群間的系統指紋圖譜卻有著明顯的變化。AP－PCR技術為鑒定基因差異提供了一種快速有效的方法。

4．3在未知病原檢測中的應用

病原微生物引起的動物疫病呈現出復雜性和非典型性等特征，普通的臨床診斷方法很難確定病原的種類，這種情況下使用傳統PCR方法檢測臨床樣品的效率不高，而且存在漏檢可能。AP－PCR技術提供了一個更為全面、快速和靈活的檢測方法，對病原微生物進行全基因組的檢測（姚四新等，2010）。Djikeng等（2008）使用DNase－SISPA技術在牛的血清中分離到牛鼻病毒基因。Clem等（2007）利用改進的AP－PCR方法，從血液樣品中檢測并獲得了3種獨立病毒的部分序列，即腺病毒17、卡薩奇病毒A7和呼吸道合包體病毒B。周斌等（2004）在研究鴨病毒性肝炎病毒時，發現其種毒可能受到污染，隨后挑選4條隨機引物對其進行反轉錄PCR擴增，共擴增出3條基因片段?？寺y序的結果表明，與禽腺病毒（雞胚致死孤兒病毒）基因組部分序列同源性分別高達99．5％、99．6％和99．5％，從而確定了鴨病毒性肝炎病毒雞胚尿囊液種毒受到禽腺病毒的污染。黃欣梅等（2011）采用DNase－SISPA對導致鴨、鵝產蛋下降的病原基因進行擴增，并在此基礎上設計了1對特異性引物成功的擴增出新型鵝黃病毒JS804毒株基因。

5、小結

篇(4)

全球每年大約有2億人感染結核，結核性腦膜炎約占10%[1]。HIV陽性患者感染后發生結核病的風險增加到1/3，并且更易誘發肺外結核-尤其是結核性腦膜炎。2007年全球大約有1370萬結核病例（206/100萬人口），其中有927萬人為新發結核病患者與2006年新發為924萬人相比有所增加[2]。在這些新發結核病人口中，約有137萬（約占14%）人為HIV陽性。2007年大約有130萬（2/10000）人口死于結核病。2009年，全球結核患病率為1400萬，發病率是940萬，結核病死亡人數為170萬人[3]。結核病數量最多的五個國家分別是印度、中國、印尼、尼日尼亞以及南非[4]。全世界確切的TBM發病率仍不清楚。在發病率最高的15的國家里，有13個在非洲，這與非洲地區艾滋病的流行相關?；谶@些數據，預期TBM的發病率在這些國家將達到每年約17％100,000人（10％的結核病患者）。在發達國家，盡管結核病的總人數在下降，但是肺外結核以及TBM的所占比例有所增高。美國一項肺外結核的流行病學調查研究發現，高達10%的肺外結核病為中樞神經系統結核，盡管美國疾病防治中心數據顯示6.3%的肺外結核（約占全部結核病的1.3%）為中樞神經系統結核。HIV陽性患者TBM的死亡率明顯增高。結核患者中，HIV陽性患者發展為嚴重形式的結核病的發生率是HIV陰性患者的五倍以上[5]。成人TB中，HIV陰性患者死亡率約為25%，而HIV陽性患者死亡率高達67%[6]。

2危險因素及病原學

結核性腦膜炎的危險因素包括年齡，合并艾滋病感染，營養不良，兒童近期麻疹感染，酗酒，惡性腫瘤，成人免疫抑制藥物的使用以及社區疾病的流行。兒童患者尤其是＜5歲的幼兒TBM的發病率顯著增高。結核性腦膜炎的致病菌為結核分枝桿菌。結核分支桿菌是一種革蘭氏陽性、需要、有芽孢的、無運動能力的放線菌目。它具有抗酸性，最常見的抗酸染色法為Ziehl-Neelsen染色法。改良羅氏培養基為培養結核分枝桿菌最常見及最廣泛使用的培養基。TBM主要發生在免疫力低下的患者中，合并HIV感染、酗酒、營養不良等患者中TBM的比例明顯增高。結核分枝桿菌主要通過飛沫傳播。結核分枝桿菌主要在肺泡巨噬細胞中繁殖。細菌通過血液循環，在2-4周內播散到肺外組織以及腦膜、腦實質相鄰部位產生結核性肉芽腫。這些病灶通常存在于腦膜和大腦表面的軟腦膜或室管膜下。肉芽腫內的結核分枝桿菌可處于休眠狀態數年。當干酪樣肉芽腫內的結核分枝桿菌進入到蛛網膜下腔時可發展為結核性腦膜炎。

3發病機理

3.1病原體因素

目前全球主要發現有四個基因譜：印度洋、東亞、東非/印度、歐美[7]。不同基因型的結核分枝桿菌的菌株致病性不同。例如，北京株的結核分枝桿菌與TBM的發病關系密切，歐美菌株主要引起肺結核[8]。此外，這兩種不同基因型的結核分枝桿菌侵犯在宿主時中臨床表現不同。例如，由東亞/北京基因型的菌株引起的腦膜炎的病程相對較短，并且表現為腦脊液中的白細胞數降低，這表明不同基因型的結核桿菌能影響疾病的進程以及顱內的炎癥反應[9]。東亞/北京型菌株與耐藥性結核以及HIV的高發病率緊密相關。泰國的一項回顧性研究發現東亞/北京菌株的一些亞型與TBM的CSF白細胞計數以及疾病的嚴重程度有關，但是與死亡率無明顯相關性。

3.2宿主因素

結核分枝桿菌是一種寄住在宿主巨噬細胞的吞噬小體中的細胞內寄生病原體。受感染的巨噬細胞凋亡是宿主殺滅結核分枝桿菌的一個有效機制。結核分枝桿菌已進化出多種基因型以對抗宿主的免疫反應，使得它能夠在宿主的巨噬細胞內長期存活和繁殖。結核分枝桿菌細胞壁中兩種重要的糖脂:前體脂甘露糖、脂阿拉伯甘露糖脂。脂阿拉伯甘露糖參與抑制了吞噬小體的成熟、細胞的凋亡、巨噬細胞的γ干擾素信號以及樹突狀細胞分泌IL-12。有研究表明，致病性的北京菌株可誘導巨噬細胞分泌大量TNF-α，IL-10，并且下調Toll樣受體-2、Toll樣受體-4以及MHC-Ⅱ類分子的表達。宿主基因的異常能增加結核分枝桿菌的易感性[10、11]。有研究發現LTAH4基因能夠干擾體內TNF水平并且通過觸發異常的炎癥反應增加TBM的易感性。一些研究人員還發現了P2X7受體（一種ATP-Ca2+門控通道）基因具有多態性。通常情況下，P2X7受體的激活可誘導宿主細胞的凋亡和感染性結核桿菌的死亡。但是具有多態性的宿主的巨噬細胞出現了凋亡障礙以及殺滅結核分枝桿菌的缺陷。目前發現Toll樣受體的多樣性與TB的發病有關。Toll樣受體有12個成員，分別能識別病原體、激活并啟動固有免疫、產生細胞因子，最終促進適應性免疫應答的形成。一項最新的調查研究顯示，Toll-IL-1受體域的適配蛋白基因的單核苷酸多態性與TBM的發病風險緊密相關。Toll樣受體-2的多態性已被證明能夠增加宿主患嚴重形式的結核如結核性腦膜炎、粟粒樣肺結核的易感性[12]。這些基因中的單核苷酸的多態性被認為是影響細胞因子的水平以及個體對結核的易感性及抵抗性。γ干擾素基因的多態性也與結合的易感性相關。宿主的易感性與多種因素相關，如患者年齡、致病菌的基因型、病原體的毒性、合并HIV感染以及其他未知的因素。

3.3免疫發病機制

TBM的免疫發病機制至今仍不十分清楚。結核分枝桿菌進入中樞神經系統，巨噬細胞立即識別它們并啟動相應的固有免疫和適應性免疫應答。隨后的炎癥反應可導致血腦屏障的破壞、腦水腫以及顱內壓的增高。小膠質細胞是CNS對結核桿菌產生免疫化學反應的主要細胞。一些研究顯示，小膠質細胞能夠產生多種細胞因子，啟動或促進中樞神經系統的免疫應答（通過促進外周組織中的免疫細胞進入腦組織）。血清及腦脊液中TNF-α、γ干擾素升高的水平與結核性腦膜炎的嚴重程度呈正相關。目前有研究證實合并HIV感染的患者中腦脊液炎癥反應可減輕。腦脊液中的γ干擾素水平的降低與死亡獨立相關，這表明γ干擾素能夠提高宿主的免疫及生存[13]。

4病理學特征

空氣中飛沫中的結核分支桿菌進入人體后觸發肺泡巨噬細胞的級聯反應。菌血癥初期，結核分枝桿菌可血行傳播至身體各個部位，包括腦膜。TBM容易侵犯大腦基底部，引起腦膜應對結核分枝桿菌抗原的強烈的炎癥反應。TBM特征性的病理學特點是腦膜的炎性反應、纖維蛋白性滲出、結核性血管炎以及腦脊液流出通路受阻導致腦積水。結核性滲出物經在腦組織表面會產生不同程度的腦水腫、血管周圍炎性細胞浸潤、反應性的小膠質細胞增生，這些反應被統稱為“邊緣性腦炎”。TBM顯微鏡下的病理學特征為上皮細胞肉芽腫形成、朗格漢斯細胞、淋巴細胞浸潤以及干酪樣壞死。70%的患者有不同程度的血管炎和腦梗死，而大腦中動脈等的大面積腦梗塞僅見于3.2%的患者。滲透、增殖性和壞死性血管炎是導致血栓形成的血管病理基礎。腦血管的變化特征為炎性反應、血管痙攣、收縮，最終導致腦血栓形成。通過炎性滲出物的腦膜靜脈也表現出了不同程度的靜脈炎?；壮睾褪夜苣さ臐B出物粘連，室間孔、中腦導水管和第Ⅳ腦室正中孔或側裂孔狹窄閉塞，腦脊液循環受阻，導致不同程度的梗阻性腦積水。

5臨床表現

醫學研究委員會量表用來評估TBM的嚴重程度。根據這個量表，TBM患者病程可分為三期:Ⅰ期的病人意識完全清醒并且無局灶性的神經系統癥狀；Ⅱ期患者可有感覺異常和局灶性神經功能缺損癥狀如輕偏癱和顱神經麻痹；Ⅲ期病人可有昏迷和嚴重的神經功能損害如多顱神經損害、嚴重的偏癱或截癱。大多數結核性腦膜炎患者在發展為腦膜刺激癥狀之前2-8周有前驅不明原因的感染等疾病病史。常見的非特異性癥狀包括:疲倦、納差、乏力、體重減輕、發熱、頭痛及肌肉酸痛。疾病發展到一定階段患者可出現顱神經損害、視力下降、局灶性神經功能缺損、頸項強直、顱內壓增高等癥狀。老年患者常缺乏非典型臨床癥狀延誤診斷。老年人結核性腦膜炎患者可出現亞急性癡呆如記憶障礙和人格改變的典型額葉樣病變。小兒患者常表現為精神行為異常。HIV陽性患者癲癇的發病率明顯增高。癲癇約發生在50%的小兒患者以及5%的成人TBM患者。癲癇患者的預后較差。低鈉血癥是TBM患者中常見的代謝異常，與預后不良相關。反復嘔吐、ADH分泌異常以及腦性耗鹽綜合征是低鈉血癥的常見原因。低鈉血癥可加重腦水腫，因此需要緊急處理。ADH分泌異常型高鈉血癥多由于下丘腦功能障礙分泌過多的ADH導致鈉水儲留，低鈉血癥多為正常容量型或高容量型。腦性耗鹽綜合征目前認為是由于抗利鈉肽水平升高導致尿鈉丟失過多，并伴隨水分的丟失。臨床補鈉不可過快，防止發生腦橋中央髓鞘溶解綜合征。顱內壓增高是TBM患者最常見的癥狀，并且與死亡率和致殘率相關。顱內壓增高最常見的原因是腦積水，其次是腦水腫。顱內壓增重者可發生腦疝形成。CT/MRI檢查可發現腦室擴大和腦積水。顱內壓增高及腦積水往往提示預后不良。約有20%-30%的患者會出現顱神經的損害。第Ⅵ顱神經損害較常見，第Ⅲ、第Ⅳ顱神經較少受累。顱神經受影響主要是因為基底部的滲出物包繞神經干或者顱內壓增高所致。視力減退也是TBM一種常見并發癥。視神經損害可能的原因為：視交叉性蛛網膜炎、大量腦積水導致第三腦室受壓壓迫視神經、視神經肉芽腫或乙胺丁醇的毒副作用。約有70%的TBM患者發生腦梗塞。梗塞的部位多位于內囊、基底節、丘腦等部位。梗塞多發生于內側丘紋動脈及丘腦穿通動脈供血區。大腦后動脈及其分支的供血區很少受累。梗死可無癥狀，也可以導致嚴重殘疾或死亡，并且與預后不良相關[14]。兒童患者中基底節和內囊梗死的預后較差。單純半球的梗塞預后良好。有證據表明，疾病早期發生的梗塞多由于血管痙攣所致，后期主要原因是血管內膜增生[15]?？菇Y核治療不能降低腦梗塞的發病率。

6診斷與鑒別診斷

TBM的早期診斷是改善臨床預后的基礎。僅根據患者的臨床表現難以確診或排除TBM，往往確診時已經發生了腦損傷。目前TBM的診斷仍缺乏一個快速、靈敏的方法。

6.1腦脊液檢查

腦脊液檢查是TBM確診的重要檢查方法。特征性的腦脊液改變有助于鑒別其他類型的中樞神經系統感染。典型腦脊液改變為細胞數增多，以單核為主，蛋白增高，糖及氯化物降低。HIV感染患者CSF中細胞數可為0。診斷的金標準為腦脊液中找到結核分支桿菌。TBM患者腦脊液抗酸桿菌涂片的陽性率僅有5-30%。腦脊液培養陽性的臨床診斷率為25%-70%，但是耗時長。HIV相關的結核性腦膜炎細菌涂片和腦脊液培養的陽性率分別為69%和87.9%。增加腦脊液樣本量以及延長涂片檢查時間（至少30min）及反復檢查可提高涂片的陽性率[16]。腦脊液的標本量、癥狀持續時間、腦脊液中中性粒細胞計數、乳酸水平、糖量均與診斷有關。ADA在全身組織中均有分布，在淋巴組織尤其是活動性T淋巴細胞中水平增高，被認為是細胞免疫的標志物。近期一項Meta分析顯示ADA診斷的靈敏度和特異性分別為79%和91%[17]。但是目前認為診斷TBM缺乏特異性，不推薦作為TBM的常規診斷方法[18]，ADA水平升高只能進一步幫助確診TBM。聚合酶鏈反應是檢測腦脊液中結核分枝桿菌的DNA的一種常用方法。腦脊液細菌培養的靈敏度和特異性分別為39%和100%，而是用PCR技術檢測的靈敏度和特異性為75%和100%。腦脊液TB培養陽性的患者靈敏度顯著提高。選擇合適的結核分枝桿菌特異性的DNA以及防止腦脊液標本污染是獲得高特異性的關鍵。腦脊液中找到結核分枝桿菌仍然是診斷的一個巨大的挑戰。一些新型的診斷方法如顯微藥物敏感性實驗（MODS）、ELISA法檢測脂阿拉伯甘露糖抗原正在研究中。

6.2影像學診斷

CT和MRI是TBM的診斷和并發癥的評估常用的影像學檢查方法。腦積水、結核瘤以及腦膜強化是TBM常見的影像學特征[19]。TBM的CT特點包括基底池的強化、滲出物，腦積水以及腦室周圍梗死灶。腦積水及基底池強化是最常見的異常表現。平掃CT上基底池高密度影被認為是敏感性和特異性的表現。脈絡膜從強化以及腦室擴大應高度懷疑TBM。常見的異常表現包括：腦積水，腦膜及基底池強化，腦梗死和局灶性/彌漫性腦水腫，結核瘤。TBM患者腦積水與腦卒中的風險及預后不良存在相關性[20]。MRI比CT檢查敏感性更高。MRI增強檢查可在疾病早期發現腦膜的強化，有報道稱高達39%的TBM患者早期MRI可出現異常表現。在MRI成像中，局部的腦膜強化比彌漫性腦膜強化更常見。此外，胸片或胸部CT發現活動性肺結核尤其是粟粒性肺結核應高度懷疑TBM。

6.3鑒別診斷

各種類型的中樞神經系統感染、血管疾病、炎癥性疾病、腫瘤都需與TBM相鑒別。有時難以同部分細菌性腦膜炎鑒別。TBM有六大特征：病程超過5天，頭痛，腦脊液細胞數＜1000×106/L，顏色淡黃或微混，淋巴細胞比例＞30%，蛋白含量增高＞1g/L[21]。一些炎癥性或自身免疫性疾病（如Wegener肉芽腫、結節?。┏艘鹉X膜的炎癥外，還會引起其他器官的炎癥。隱球菌性腦膜炎患者中頭痛通常是最主要的有時甚至是唯一的臨床表現。隱腦患者中腦膜刺激征常不明顯，神經影像學檢查往往也是正常的。腦脊液墨汁染色找到隱球菌可確診。弓形蟲感染患者也可以表現為彌漫性的腦膜炎癥。腦脊液中葡萄糖的濃度明顯降低時，應考慮到癌性腦膜炎的可能。約有5%的腫瘤患者出現癌性腦膜炎。原發性彌漫性腦膜膠質瘤是一種罕見情況，即異位細胞巢的神經膠質瘤種植在軟腦膜上產生類似于慢性感染性炎癥的表現。

7結核性腦膜炎和人類免疫缺陷

病毒HIV感染患者TBM的發病率和死亡率明顯增加。一些研究發現，HIV感染并不會改變TBM患者的臨床表現、實驗室檢查結果、影像學表現以及對治療的反應。HIV陽性患者CD4+細胞計數明顯減少。HIV感染會削弱CSF的炎癥反應，大多數HIV患者腦脊液中可無炎性改變[22]。然而，另外一些相反的研究表明，HIV-陰性TBM患者與HIV-陽性TBM患者臨床表現仍存在不同。例如，有研究指出HIV感染患者中胸片提示活動性肺結核的比例更高，而TBM的經典CT成像（梗阻性腦積水和基底池強化）卻不太突出。HIV-陰性患者顱內占位性病變更加常見。已有報道多重耐藥性TBM的感染及腦脊液的非炎癥性改變。早期的研究發現，HIV感染的TBM患者的嗜中性粒細胞增多、腦脊液細菌涂片及培養的陽性率高，對抗結核藥物的耐藥性高。

8多重耐藥性結核性腦膜炎

（MDR-TBM）耐藥性TBM已成為一個日益嚴重的問題，多重耐藥性結核性腦膜炎的死亡率高達100%[23]。2007年，全球大約有50萬例多重耐藥性結核病,2008年約有44萬MDR-TBM患者，其中印度和中國患者約占一半比例。在結核高發病率國家中，MDR-TBM所占比例約為1%-14%甚至更高。HIV患者中結核菌的耐藥性更常見。單純異煙肼耐藥或合并鏈霉素耐藥對患者的生存率無明顯影響，但是合并HIV感染的患者死亡率明顯升高。

9臨床治療及預后

TBM患者應早期開始抗結核治療?？菇Y核治療往往需要在找到結核桿菌之前的經驗治療。常用的一線抗結核藥物有異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、鏈霉素、乙胺丁醇。二線抗結核藥物有乙硫異煙肼、環絲氨酸、對氨基水楊酸、卷曲霉素等。喹諾酮類藥物主要用于耐藥性結核的抗菌治療。大多數一線抗結核藥物（乙胺丁醇除外）都能很好的通過血腦屏障。

9.1抗結核藥物治療方案目前，對TBM的抗結核治療仍沒有一個統一的標準。世界衛生組織推薦以抗結核為基礎的治療。目前對TBM患者推薦至少3個月的強化治療和至少6個月的鞏固治療。強化治療方案包括四種一線抗結核藥物：異煙肼、利福平膠囊、吡嗪酰胺和鏈霉素。TBM患者中抗結核治療的鞏固階段通常延續7-10個月。美國胸科協會指南推薦TBM較長時間（9-12個月）的抗結核治療。HIV陽性患者的抗結核治療與HIV陰性患者治療相同。當患者對合適的抗結核藥物的反應不佳或既往有耐藥性肺結核病史時應考慮到多重耐藥性結核性腦膜炎的可能。有效的指南推薦抗結核方案至少包括五種藥物。治療方案應包括鞘內注射抗結核藥物。在這五種藥物中，必須包含喹諾酮類。治療包括初始的6個月強化治療以及后期12-18個月的鞏固治療。隨著廣泛耐藥性結核病的出現（一種耐多藥結核病至少對異煙肼和利福平，所有氟喹諾酮類，和至少一個的可注射的藥物，如丁胺卡那霉素，卡那霉素，卷曲霉素等產生耐藥），對TBM的治療提出巨大的挑戰。免疫重建炎癥綜合征在合并HIV感染的結核患者中也存在致命性的危險。這一并發癥可能在使用抗逆轉錄病毒治療初期或治療后3個月后出現。免疫重建炎癥綜合征的特點是CD4+細胞計數的減少。同時服用抗結核藥物和抗逆轉錄病毒藥物可能會產生明顯的藥物的相互作用。例如，有利福平誘導的細胞色素P-450、P-糖蛋白導致非核苷類逆轉錄酶抑制劑，尤其是蛋白酶抑制劑的濃度降低。這一效應潛在性削弱了抗逆轉錄病毒藥物的療效。

9.2類固醇激素激素可以明顯降低TBM的死亡率以及減輕存活者的神經功能缺損。有研究證明使用地塞米松可改善TBM的預后，這可能是因為地塞米松能減輕腦水腫以及腦梗死的發生率。皮質類固醇激素在TBM患者中的具體作用機制仍不明確。目前認為TBM患者的高死亡率和致殘率與顱內的炎癥反應嚴重性有關。皮質類固醇激素可能由于減輕腦實質和腦膜的炎癥反應、腦水腫以及顱內壓增高。皮質類固醇激素被認為可以調節巨噬細胞產生細胞因子和趨化因子。Simmons和他的同事證明，皮質類固醇激素治療改善預后并不是因為介導腦脊液中免疫炎癥介質的改變或者通過抑制外周T細胞對對結核分枝桿菌的免疫應答[24]?；|金屬蛋白酶為細胞外基質降解的介質并且與CNS的一些炎癥反應的發病機制有關。最新一項研究證實，地塞米松能夠在治療早期降低腦脊液中金屬蛋白酶-9的濃度。作者認為，這可能是皮質類固醇激素能夠改善TBM預后的機制之一[25]。

9.3預后TBM的早期診斷和治療是提高預后的關鍵。然而，抗結核治療只能使不到50%的患者免于死亡和殘疾。成人皮質類固醇激素的使用與死亡率的下降明顯相關。在疾病早期階段開始使用激素可明顯降低死亡率和致殘率。一些研究認為腦脊液中細胞比例，尤其是白細胞計數減低與死亡率呈正相關。存活患者與腦脊液中淋巴細胞比例減少及中性粒細胞比例升高，這提示中性粒細胞的比例有保護作用?；颊吣挲g＜5歲，＞50歲以及病程超過2個月的患者死亡率最高。兒科的一項研究發現，治療后只有20%患者能夠完全恢復，80%的患者死亡或者殘疾。在大多數研究中，疾病的分期是與死亡率相關的一個關鍵因素。一些研究指出，五大因素與預后相關：疾病的Ⅲ期階段，低血糖水平，CSF/外周血血糖比，CSF蛋白水平，以及影像學檢查異常。在對TBM患者預后的多因素logistic回歸分析發現，種族、疾病的分期、抽搐、運動功能、腦干功能障礙以及腦梗死為TBM預后的獨立危險因素[26]。合并HIV感染的TBM患者死亡率更高。在一項比較研究中，HIV感染患者死亡率為63.3%、而HIV陰性患者死亡率僅為17.5%。

10小結與展望

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1.1基因擴增技術1983年美國Cetus公司的Mullis發明了聚合酶鏈反應技術(polymerasechainreaction,PCR)，該技術利用DNA高溫變性和低溫復性的原理，通過變性、復性和延伸3個溫度變化，成功實現核酸片段的體外擴增。PCR技術以其特異性高、靈敏度高、簡便、快速，對標本的純度要求低等優點，被廣泛應用到醫學、農業、食品檢驗等領域。PCR技術分為兩種：常規PCR技術和實時PCR技術。常規PCR技術，指僅對PCR擴增反應的終點產物進行定性或半定量分析，無法對起始模板準確定量，也無法對擴增反應實時檢測的一項核酸擴增技術，但該技術所需技術平臺和儀器設備較低，花費成本相對也低，目前臨床上主要運用該平臺對定性項目進行檢測，例如：缺失基因、突變基因、融合基因等的檢測。實時PCR技術，又稱實時定量熒光PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的技術。實時PCR技術，具有特異性強、準確度高、重復性好等特點，在檢驗醫學上主要應用于核酸定量、mRNA表達水平分析等，可以分析和指導臨床用藥、監測藥物療效、判斷病情進展。

1.2基因測序技術1977年Maxam提出了化學修飾降解法模型，為核酸測序時代的到來拉開序幕。同年，Sanger等發明了DNA雙脫氧鏈末端終止法，可以檢測物種或細胞的核酸序列，再與基因庫進行比對，從而知道被檢測物種或細胞的特性。Sanger法作為最經典的測序方法，讀取序列長，能夠較好地處理重復序列和多聚體，仍為目前常用的測序方法，廣泛應用于基因組DNA、cDNA等多重復序列的檢測。該技術不足之處：靈敏度較低，通量較低。1998年Ronaghi發明了焦磷酸測序法，其基本原理是利用引物延伸時所釋放的焦磷酸基團激發熒光，通過峰值高低判斷與其匹配的堿基數量。比起Sanger法，提高了靈敏度，在SNP位點檢測、等位基因突變測定等廣泛運用。近幾年，發明了高通量測序技術，是對傳統技術的一次革命性的創新。該技術通過DN段化構建DNA文庫、文庫與載體交聯進行擴增、在載體面上進行邊合成邊測序反應，完成對海量數據的高通量測序。該技術測序速度快、準確度高，可以進行大規模的測序檢測，主要應用于全基因組序列、內含子序列、外顯子序列等的分析和研究。

2分子診斷學技術在檢驗醫學中的應用

分子診斷就是應用分子生物學技術，在遺傳物質的結構或表達水平，通過檢測特定基因存在、轉錄及表達異常，對人體狀態和疾病作出診斷的方法。分子診斷學在檢驗醫學中的應用，使越來越多的疾病的發生發展的分子機制得到闡明，為臨床醫生對疾病的診斷、治療和預后，提供最為直接、最為準確的依據。目前分子診斷學技術在感染性疾病和遺傳性疾病中的應用最為廣泛。

2.1分子診斷學技術在感染性疾病的應用感染性疾病是指外源病原體入侵機體后，生物體無法排除該病原體而產生一系列不適的反應。一般通過病原體培養或血清學方法進行病因查找。酶聯免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)是目前檢驗醫學實驗室檢測免疫學指標應用最廣泛的方法之一，廣泛應用于乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病等感染性疾病的診斷檢測和診斷，具有靈敏度高、特異性強、快速簡便等優點，但是一些影響因素不容小覷，臨床待檢標本常受溶血、黃疸、脂濁等因素的影響，導致檢測結果判斷錯誤。血清學也只能確定機體是否接觸病原體，不判斷是否是現行感染。PCR和基因芯片技術應用于病原微生物的檢測，具有敏感性高、耗時少、效率高等優點。例如：利用實時熒光定量PCR技術檢測乙肝病毒DNA的載量，與傳統的酶聯免疫法相比，既可以提示疾病的嚴重程度，也可以監測藥物療效、預后與復發。分子診斷學技術在感染性疾病的應用，可彌補血清學檢測技術的缺陷，主要包括以下幾個方面：(1)檢查不能培養或生長緩慢的病原微生物；(2)通過病原微生物的定量檢查監測病情；(3)微生物耐藥性的檢查；(4)細菌分型及流行病學調查。

2.2分子診斷學技術在遺傳性疾病中的應用遺傳性疾病是指遺傳因素占主要發病原因的某些疾病，幾乎都存在一定的基因缺失或突變。分子診斷學技術是指通過分析患者體內遺傳物質結構或表達水平的變化，對人體健康狀態和疾病作出或輔助診斷的方法。分子診斷學技術已經能夠診斷已知致病基因的遺傳性疾病，對一些基因突變所致的遺傳病也有良好的診斷意義，也能利用遺傳標志來診斷一些病因未明的疾病。例如，鐮狀細胞貧血：β-珠蛋白基因中第6位密碼子的序列由原來的GAG改變為GTG，編碼的血紅蛋白為鐮狀細胞血紅蛋白。通過PCR技術可以將包含突變位點的β-珠蛋白基因片段擴增，根據產物分析的結果可以對該遺傳性疾病進行診斷?；诨蛐酒夹g，對基因SNP進行分型，檢測遺傳性耳聾基因，發現50%的兒童期耳聾與遺傳因素有關。采用序列特異性引物聚合酶反應(polymerasechainreac-tionwithsequencespecificprimer,PCR-SSP)技術對白介素18基因啟動子區-607C/A、-137G/C基因型多態性進行分析，從而發現該基因啟動子區-607C/A、-137G/C多態性與江西人群哮喘未見相關性。利用高通量測序技術，結合生物信息學，可以準確預測胎兒發生某些遺傳性疾病的風險，從而達到降低畸形兒出生率的目的，例如：21-三體綜合征(唐氏綜合征)、18-三體綜合征(愛德華綜合征)等。

3現狀和挑戰

分子診斷以PCR為基礎，自從發明以來，廣泛地應用于疾病診斷、療效檢測和預后判斷，有力推動了檢驗醫學的發展，開辟了檢驗醫學的新領域，給檢驗醫學帶來機遇與挑戰。在美國和歐洲等發達國家，分子診斷已經成為了醫療診斷不可或缺的重要組成部分，為人民的健康保駕護航發揮重要的作用。國內的分子診斷學技術在檢驗醫學中的應用，雖取得一定程度的發展，但是始終落后臨床的發展，難以滿足臨床診斷的要求，分子診斷項目開展較少，重視程度不夠，應用緩慢。以下從兩方面分析我國分子診斷學技術應用于檢驗醫學的現狀及存在的問題。

3.1分子診斷檢測平臺現在檢驗醫學的發展方向是自動化和一體化，分子診斷學技術努力實現檢測儀器、試劑和校準品的一體化，從而避免實驗室之間結果的差異。我國的分子診斷在檢驗醫學中的應用平臺，還處在起步階段，實現自動化尚需時日。目前我國在核酸提取、擴增反應系統準備、擴增前加樣、上機、產物和結果分析等方面仍是以手工操作為主。歐美國家基本上采用自動化核酸提取系統，既可以提高工作效率，減少生物暴露時間，還避免操作人員個體差異對實驗結果的影響，提高結果的可重復性和準確性。目前我國應用于檢驗醫學的主流分子診斷學技術是實時熒光PCR技術，主要用于感染性疾病病原體核酸的檢測，而歐美發達國家，檢測平臺較為多樣，主流技術為測序，分子診斷涵蓋了感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤等領域。

3.2技術人員的水平與能力分子診斷檢驗項目質量控制涵蓋多個方面，包括分析前、分析中、分析后的各個層面，因此對技術人員、儀器、標本、環境要求更加嚴格。目前我國對分子診斷學技術人員的培訓尚不到位，技術人員在實驗操作、結果報告、臨床咨詢方面尚有很多不足之處。隨著人們對人類基因組功能研究的深入，人們對生命、疾病、衰老、死亡的認識更深。分子診斷涉及個體的基因差異，要求相關技術人員能夠提出專業的意見，指導預防疾病、降低患病風險，以及實現個性化治療等，這就對從事分子診斷學技術的工作人員的水平和素質提出更高的要求。

4前景和展望

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1醫學論文的基本要求

1.1創新性醫學論文的創新性是指文章要有新意，要發展醫學成就，破解醫學問題。醫學論文有無創新，選題是關鍵。選題創新是醫學論文寫作的靈魂，是衡量醫學論文價值的重要標準?？审w現在：①理論方面的選題應有創新見解，既要反映作者在某些理論方面的獨創見解，又要提出這些見解的依據；②應用方面的選題應有創新技術等，也就是要寫出新發明、新技術、新產品、新設備的關鍵，或揭示原有技術移植到新的醫學領域中的效果；③創新性還包括研究方法方面的改進或突破。

1.2可行性所謂選題的可行性，是指能夠充分發揮作者的綜合條件和可以勝任及如期完成醫學論文寫作的把握程度。選題切忌好高鶩遠，脫離實際，但也不應過低，影響主客觀的正常發揮，降低了醫學論文的水平。影響選題的可行性因素有：①主觀條件，包括作者知識素質結構、研究能力、技術水平及特長和興趣等；②客觀條件，包括經費、資料、時間、設備等。

1.3實用性撰寫醫學論文的目的是為了交流及應用。要從實際出發，選擇夠指導科研、指導臨床、造福人類的主題，因此，選題的實用性尤為重要。

1.4科學性醫學論文是臨床和醫學科學研究工作的客觀反映，其寫作的具體內容應該是取材客觀真實、主題揭示本質、科研設計合理、論證科學嚴謹、表達邏輯性強、經過實踐檢驗。所以，嚴格遵守選題的科學性原則，是醫學論文寫作的生命。

1.5前瞻性要選擇有研究價值及發展前途的主題，應積極開發研究新領域、新學科和新理論。

2選題的基本方法

2.1根據課題研究的結論來確定主題這是常用的方法，可分為：①以科研的結論或部分結論作為醫學論文的主題；②科研結果與開題時預測不一致，待查出原因后，再尋找主題；③科研達不到預期結果，可總結經驗，從反面挖掘主題。

2.2在科研過程中選題醫學科研的過程中，有時會出現意外的現象或問題，作者如果能夠細心觀察、及時發現，可以在這些偶然中獲得新的選題。

2.3在臨床實踐中選題臨床工作是醫學論文寫作取之不盡的源泉，作者在臨床中會經常遇到許多需要解決的實際應用問題或理論問題，對此，只要從本學科實際出發，用心思考，會從中產生很多好的主題。其包括：①探討發病機制與預后情況；②分析臨床癥狀與表現；③研究診斷方法和治療方法；④疾病的多因素分析等。

2.4從文獻資料中選題醫學文獻是人們長期積累的寶貴財富，是醫學論文選題的重要來源。閱讀最新文獻資料，可以了解當前醫學科學研究的進展情況，開拓思路、激發靈感，從而挖掘提煉出好的醫學論文主題。

3醫學論文的一般體裁

3.1實驗研究一般為病因、病理、生理、生化、藥理、生物、寄生蟲和流行病學等實驗研究。主要包括：①對各種動物進行藥理、毒理實驗，外科手術實驗；②對某種疾病的病原或病因的體外實驗；③某些藥物的抗癌、抗菌、抗寄生蟲實驗；④消毒、殺蟲和滅菌的實驗。

3.2臨床分析對臨床上某種疾病病例（百例以上為佳）的病因、臨床表現、分型、治療方法和療效觀察等進行分析、討論，總結經驗教訓，并提出新建議、新見解，以提高臨床療效。

3.3療效觀察指使用某種新藥、新療法治療某種疾病，對治療的方法、效果、劑量、療程及不良反應等進行觀察、研究，或設立對照組對新舊藥物或療法的療效進行比較，對比療效的高低、療法的優劣、不良反應的種類及程度，并對是否適于推廣應用提出評價意見。

3.4病例報告主要報告罕見病及疑難重癥；雖然曾有少數類似報道但尚有重復驗證或加深認識的必要。

3.5病例（理）討論臨床病例討論主要是對某些疑難、復雜、易于誤診誤治的病例，在診斷和治療方面進行集體討論，以求得正確的診斷和有效的治療。臨床病理討論則以對少見或疑難疾病的病理檢查、診斷及相關討論為主。

3.6調查報告在一定范圍的人群里，不施加人工處理因素，對某一疾?。▊魅静?、流行病、職業病、地方病等）的發病情況、發病因素、病理、防治方法及其效果進行流行病學調查研究，給予評價，并對防治方案等提出建議。

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關鍵詞：醫學教育研究；文獻分析；合作度；參考文獻

《中華醫學教育雜志》是醫學教育專業研究領域最重要的交流平臺和信息來源[1]。在1994年，作者曾對該刊（當時為《醫學教育》）1986～1992年83期發表的全部論文的論文作者合作度、論文作者單位合作度進行了統計與分析[2]。時隔25年（1986～2010），《醫學教育》雜志已經更名為《中華醫學教育雜志》，近年更是進入到中文核心期刊范疇[3]。為了反映期刊論文作者合作度在新形勢下出現了哪些變化，本文對《中華醫學教育雜志》2008～2010年3卷18期雜志的論文作者合作度再次進行統計分析，并與25年前資料進行對比。

1資料與方法

1.1一般資料 為《中華醫學教育雜志》2008，2009，2010共3卷18期雜志全部論文。

1.2統計方法 對統計對象以篇為單位分別逐條統計，包括各期雜志論文篇數、每篇論文的作者數以及涉及的作者單位，最后求出論文作者合作度以及論文作者單位合作度。再與既往資料對比分析。

2結果

參見表1、表2、表3。另統計了《中華醫學教育雜志》論文作者涉獵的學科以及分類，按照來源期刊可分為7個類別：醫學教育、醫學專業期刊、普通教育學、醫學院校學報、普通大專院校學報、科學技術類和社會科學經濟文學類等。

3討論

3.1論文作者署名人數構成以及論文作者單位數量構成均較25年前發生了明顯變化：2008～2010年度《中華醫學教育雜志》論文作者署名人數主要集中在2～5位，單一作者發表的論文由61.46%改變為11.29%；而論文作者單位數量構成也由單一單位占94.94%降低為61.09%，而由2～3個單位間合作的論文數量由4.83%大幅增加到34.16%。

3.2論文作者合作度與論文作者單位合作度明顯提高，論文作者合作度由1.69改變為3.81；論文作者單位合作度也由1.06增加到1.61。

3.3《中華醫學教育雜志》論文作者合作度增加的意義 根據論文作者署名人數構成的變化（單一作者數量比例的大幅下降），論文作者單位數量構成發生的變化（多單位合作的論文數量大幅增加），結合論文作者合作度與論文作者單位合作度均較25年前明顯提高的結果，反映了近年醫學教育工作者的研究廣度在明顯增加。醫學教育工作者研究廣度的增加，必然會有深度的體現。醫學教育是教育學與醫學兩大體系的綜合體，醫學專業的特殊性與教育學的普遍性如何結合，是需要醫學教育工作者不斷去體會與努力地。

3.4醫學教育工作者在掌握本專業知識的同時，需要不斷地擴大知識面、涉獵面要廣 在提供參考文獻的773種中文雜志中，共提供中文參考文獻3596條，其中19種醫學教育專業期刊共提供引文條數1476條，即2.46 9%（19/773）的醫學教育專業期刊提供了41.05%（1476/3596）的中文參考文獻。其次為醫學專業期刊與普通教育學期刊，分別提供26.06%與16.18^%的中文參考文獻，但兩者涉及到的期刊種類分別達到270種與132種。由此可見，醫學教育工作者除了專業知識以外，尚需掌握醫學教育學的相關知識，同時也需要熟悉普通教育學知識，了解社會科學知識、科普知識。

參考文獻：

[1]李曉霞，耿民建，甘業華，等.《中華醫學教育雜志》2002年至2006年載文被引分析[J].中華醫學教育雜志，2008，28（4）：126-128.

[2]張東海，田華.醫學教育研究的廣度與深度亟待增強--《醫學教育》雜志論文作者合作度分析[J].中國科學技術出版社，1994：430-432.

[3]《中華醫學教育雜志》編輯部.中華醫學教育雜志》入選"中國科技論文統計源期刊"[J].中華醫學教育雜志，2010，30（6）：853.

[4]李曉霞，耿民建，甘業華.《中華醫學教育雜志》不同時期狀況的比較分析[J].中華醫學教育雜志，2009，29（5）：59-62.